蛋白质复性-厦门科学技术信息研究院.DOC

PAGE PAGE 5 重组包涵体蛋白质复性 邹平 基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。 一、包涵体蛋白 1、包涵体的形成 包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。 2、减少包涵体形成的策略 降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。 在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。 　在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。 　利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。 3、包涵体破菌、分离、洗涤 常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。 4、包涵体的溶解去折叠 一般用强的变性剂如尿素、盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，尤其在碱性条件下，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化。高浓度的变性剂会严重破坏蛋白质的二级结构，产生不可逆变性，导致无法复性。包涵体溶解时要采用尽可能低的变性剂浓度。 极端pH和变温被用来溶解包涵体，以替代高浓度的变性剂。但高pH值会降解蛋白质的N端。 用去垢剂SDS、TritonX-100、Sarkosyl等，破坏蛋白内的疏水键，溶解包涵体蛋白质。 对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间和链内的非活性二硫键，需加入还原剂，如巯基乙醇、DTT、二硫赤藓糖醇等破坏二硫键。 当蛋白表达量很高时，包涵体的在位溶解是一种非常有效的方法。但在位溶解会引起许多杂质成分的释放，导致蛋白质复性的收率下降。 二、包涵体蛋白质的复性折叠机制（几种假说） 蛋白质的一级结构完全包含了形成高级结构的全部信息，其组成中的氨基酸本身的特性是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础。多肽链的折叠是一个自发的过程，主要取决于给定氨基酸的序列，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。 多年来，在蛋白质折叠的研究中存在许多假说，最初的假设都认为折叠步骤为：二级结构小片段形成折叠核，此核再形成功能区域，形成“熔球态”，此后，分子立体结构再做一些局部调整，最终形成正确的立体结构。传统的化学动力学的模型集中研究此中间态转换机制。 近年来关于蛋白的折叠过程和机制的研究很多，多维能量观（Multidimensional energy landscape）学说或折叠漏斗（Folding funnel）比较有代表性。 多维能量观和折叠漏斗的模型可以预测蛋白复性的多动力路径，实验证明蛋白复性是远多于“熔球态”一个折叠路径的。而统计学的研究则侧重于蛋白向复性状态转换的整体能量观。Dill, K.A的观点，认为蛋白复性更像多个球沿轨道滚落，而不是一个球在平面上漫无目的的滚动。可用能量和适合度的景观来解释，此能量景观把单个的微观行为和宏观的现象联系起来，涉及折叠动力学的波动平衡，并发展了新型快速的计算方法。 折叠动力学应用微观理论和模型来研究，这个模型展示了蛋白折叠可用漏斗型的能量景观来描述(如图1)。漏斗的深度代表稳定构像的侧链相互作用的自由能，而宽度代表侧链的熵。在低的位置，能量景观表示能量更低，更接近天然结构，此时构像就越少。漏斗模型可以模拟大量的变性分子从不同构像如何快速折叠为一个天然