生化实验-蛋定量分析实验报告.docxVIP

蛋白定量分析实验 实验一 双缩脲法测定蛋白质含量 一．实验目的 掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和标准曲线的绘制。 二．实验原理 在碱性溶液中，具有两个或两个以上肽键的化合物（如蛋白质）可与Cu2+结合生成紫色化合物（双缩脲反应），颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的浓度。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于520nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。 三．实验仪器及试剂 容量瓶、试管、试管架、恒温水浴槽、吸量管、分光光度计、比色皿 试剂：①标准酪蛋白溶液10mg/ml ②双缩脲试剂: 溶解2.5g CuSO4·5H2O于100ml水中，加热溶解，取酒 石酸钠10g、碘化钾5g，溶于500ml水中，再加5mol/L NaOH溶液300ml 混合，倒入硫酸铜溶液，加水至1000ml = 3 \* GB3 \* MERGEFORMAT ③小鼠肝脏蛋白原浆 四．实验内容 （1）取小试管7支，编号，按下表注入溶液 试剂（ml） 管号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 — 原浆0.1 生理盐水 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 0.9 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 混匀后，于37℃水浴中保温15min，在520nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。 按表中第七管的数据加入溶液，在37℃水浴中放置15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每100ml小鼠肝脏蛋白原浆溶液中蛋白质的克数。 五.实验数据记录及结果分析 管号 1 2 3 4 5 7 吸光度 0.069 0.238 0.390 0.528 0.659 0.107 绘制曲线如下： 由图可知，当吸光度为0.107时，相对应的蛋白质克数为1.38 mg，则100ml小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质克数为1.38 g。 实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一．实验目的 掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光 度计的使用。 二．实验原理 考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在一定蛋 白质浓度范围内，结合物在595 nm波长下有最大吸收峰，测其光的吸收量即可得结合蛋白质的量。 三．实验仪器及试剂 仪器：分光光度计，试管，吸量管，比色皿 试剂：①考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 ml。 ②标准蛋白溶液500μg/ml = 3 \* GB3 \* MERGEFORMAT ③50倍稀释后的小鼠肝脏蛋白原浆 四．实验内容 （1）取试管三支，按下表操作： 试剂（ml） 空白管 标准管 样品管 生理盐水 0.1 - - 标准蛋白溶液 - 0.1 - 样品 - - 0.1 考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0 5.0 混匀，室温放置5min，在波长595nm处调零，测定各管吸光度值。 五．实验数据记录及结果分析 测得标准管与样品管的吸光度分别为0.418，0.222 则 样品中蛋白质的含量μg/ml=(0.222/0.418)×500=265.6μg/ml 则 稀释前小鼠肝脏蛋白原浆中蛋白质的含量为13.3mg/ml。 实验三 紫外分光光度法测定蛋白质含量 实验目的 掌握紫外吸收法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光度计的使用。 实验原理 蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸，使蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 实验仪器与试剂 试剂：①标准蛋白质溶液1mg/ml ②30倍稀释后的小鼠肝脏蛋白原浆 仪器：紫外分光光度计，吸量管，试管，比色皿 实验内容 280nm的光吸收法 取试管7支，按下表操作： 试剂（ml） 管号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 - 原浆1.0 生理盐水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0 3.0 混匀后，在石英比色皿中，用紫外分光光度计，以第6管调零，在280nm下测定各管吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线 五．实验数据记录及结果分析 管号 1 2 3 4 5 7 吸光度 0.149 0.267 0.323 0.476 0.570 0.236 绘制曲线如下： 由图可知，当吸光度为0.236时，相对应的蛋白质浓度为0.243 mg/ml，则稀释前小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质浓度为48.6mg/ml