流感病毒RNA荧光RTPCR检测技术.docxVIP

流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术 实吋荧光定量PCR是在常规PCR基础上发展起来的定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后根据ct值和标准曲线，对 未知模版进行定量分析。常用的实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记的SYBR Green 法和特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。 一、 实时荧光定量PCR原理： 1、SYBR Green 法： SYBR Green是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双 链DNA+后发出荧光信号，其强度与双链DNA的数暈相关，随着扩增产物暈的增加，检测到 的荧光信号增强。 2^ TaqMan 法： 在扩增反应液屮，加入一特异性探针，该探针5 端和3端分别标记一个荧 光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置靠近，5 端报告基团的荧光能 量被3端淬灭基团吸收，此时检测不到荧光信号，在扩增过程屮，探针与模板结合形成Taq 酶的5 -3,外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处吋，发生链的置换，Taq酶的 5 -3外切活切将探针5 端连接的报告基团从探针上切割下來，5端报告基团的荧光 能量脱离3端荧光淬灭基团的吸收，可检测到荧光信号，每经过一个PCR循坏，荧光信 号也和扩增产物一样，有一个同步增长的过程。 3、分子信标法： 探针设计成茎环结构的发夹状，环部核昔酸序列与扩增产物序列互补，两端核昔酸序列 互补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报 告基团和淬灭基团空间位置靠近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，此时，检测不到荧 光信号，与模板结合后，探针的构象由发夹状改变为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检 测到荧光信号。 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死 病毒也可以检测到。木章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR） o 流感病毒的基因组是负链RNA,在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA,即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因 此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT?PCR。 RT-PCR需要--对型别特异引物，四种脫氧核昔酸（dNTPs） , RNA模板, 逆转录酶及Taq DNA多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成 cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25?30个循环，使DNA产物达到倍增的效 果。 二、 试剂器材设备和器械 咽拭子液的配制:一瓶MEM液500ml, +8万单位庆大1.25ml,分装在5ml小管中,每 管4ml。小管最好高压。 1、 RNA提取试剂盒荧光PCR检测试剂盒 提収试剂盒组分：洗脱液(Elution Buffer)、载体核酸(Carrier RNA)、裂解结合增强 液(Lysis/Binding Enhance)、裂解/结合液(Lysis/Binding Soln)、磁珠(RNA Binding Beads)、 洗涤液 1 (Wash Soln 1)、洗涤液 2 (Wash Soln 2) 荧光PCR检测试剂盒组分：2XRT-PCR反应液(2XRT?PCR Buffer)、25 XRT-PCR酶 混合液(25XRT-PCR Enzyme Mix)高G/C含量引物/探针检测增强剂(Detection Enhancer) 无核酸降解酶的水(Nuclease-free Water) 无水乙醇无水异丙醇 2、 生物安全柜移液器微型离心机微型漩涡式混合器微型离心管PCR管冷冻盒带 滤头吸头低温冰箱U型样品处理板96孔磁力板 三、操作步骤 样本的处理 (在样本处理区进行) 根据咽拭子标本数，计算好所需配制的裂解液和磁珠混合液的暈，即待测样本数+阴性对 照+甲型对照+乙型对照+ —个样本量为损耗。需要配制的液体仅仅是洗液：洗液1：向Wash Soln Cone. 1瓶中加入12毫升无水异丙醇(100%)。摇匀后室温保存；洗液2：向Wash Soln Cone. 2瓶中加入32亳升无水乙醇(100%)。摇匀后室温保存。将含拭子的转运液震荡2 分钟，取50微升上清液进行核酸抽提。剩余溶液?80°C保存。 配制裂解/结合液 每反应 lul Carrier RNA,每反应 65ul Lysis/Binging Cone.,每反应 65ul 无水 异丙醇。摇匀后室温保存备用。 配制磁珠混合液 每反应 10ul Lysis/Binging Enhance,每反应 10ul RNA binding Beadso 混匀后 4°C保存备用。 裂解/结合 U型板中顺次加入20ul磁珠混合液、50ul预处理后的样品、130裂解/结合液。 漩涡振荡器上轻微振荡5分钟，完成溶液