蛋白质印迹-力20101129.pptVIP

Western blot 实验技术;概 论; Western blot ： 把电泳分离的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗体反应进行特异性检测的过程。 是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）的靶蛋白。 ;Western blot是检测蛋白质混合溶液中目的蛋白的定性方法，也可作为确定目的蛋白在不同细胞或同种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法;Western blot测定的不是蛋白的绝对含量，只是目的蛋白的相对含量： 目的蛋白的存在与否 特定实验条件下目的蛋白表达量的变化 多种因素影响信号的强弱受，一般仅作为半定量指标 不同目的蛋白由于所用检测的抗体不同，其含量不具有可比性;Western Blot一般流程;;1.蛋白样品提取： 总体原则? 1）提取时尽可能只集中于提取目的蛋白。 通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品 2）保持蛋白的处于溶解状态 通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择 3）提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等， 低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子 通过加入核酸酶或采取不同提取策略 5）样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。