ELISA步骤、试剂及注意事项.docVIP

ELISA步骤、试剂及注意事项 操作步骤方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。　　方法二　用于检测未知抗体的间接法：　　　　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 试剂器材　　1.　试剂　　(1)　包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):NaCO3?1.59克　NaHCO3　 2.93克　　加蒸馏水至1000ml　　 (2)　洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M　KH2PO4 0.2克　Na2HPO4·12H2O　2.9克　NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml　　(3)　稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克　加洗涤缓冲液至100ml　或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10％使用。　　(4)　终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。　　(5)　底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml　0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml　加蒸馏水50ml。　 （6）TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2　32μl　　(7)　ABTS使用液:ABTS　0.5mg　底物缓冲液(PH5.5) 1ml　3％H2O2　2μl　 （8）抗原、抗体和酶标记抗体。　　(9)　正常人血清和阳性对照血清。　　2.　器材:　　(1)　聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。　　(2)　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。　　(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。 ? 注意事项　　1.　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。　　2.　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:　　(1)　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。　　（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。　　(3)　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样