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报告基因分析技术 一、报告基因 报告基因(reporter gene)是指其表达产物易被检测，且易与内源性背景蛋白相区别的基因。报告基因技术是通过把已确定的顺式调控序列剪接到报告基因上来控制基因的活性，这些反应元件可以对宿主细胞中基因调控和表达的变化起反应，从而就可以直观地“报道”细胞内与基因表达有关的信号级联。报告基因的优点是细胞内背景活性低，而且可以将细胞表面的信号放大,产生一个高敏感、易检测的反应。报告基因的选择依赖于所使用的细胞系和实验的性质，以及对相应检测方法的可行性。报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连, 先让质粒在大肠杆菌中进行增殖, 再提取质粒, 转染入感兴趣的真核细胞中。 作为报告基因必须具备以下特点： 1、由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别； 2、细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测； 3、报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。 报告基因的种类很多，根据对其表达产物的分析检测方法的不同，可将其分为体外报告基因和体内报告基因。前者的分析需要在含有报告分子的细胞裂解液或细胞、组织培养液（分泌型报告基因）中进行报告分子的定量。较典型的有氯霉素乙酰基转移酶基因（CAT）、人生长激素基因（hGH）及分泌型碱性磷酸酶基因（SEAP）等。后者的分析可以在活的细胞或组织中，或在已经组化固定的组织或细胞中进行。较典型的如绿色荧光蛋白基因（GFP）。而β-半乳糖苷酶基因（β-Gal）和萤火虫荧光素酶基因既可以在体外分析也可以在体内分析。 二、报告基因的种类 2.1 氯霉素转乙酰酶报告基因 ( chlormnphenicol acetyltransferase, CAT) 氯霉素转乙酰酶报告基因 (CAT)：该报告基因来源于大肠杆菌 HYPERLINK /item/%E8%BD%AC%E4%BD%8D%E5%AD%90 \t _blank 转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定， HYPERLINK /item/%E5%8D%8A%E8%A1%B0%E6%9C%9F \t _blank 半衰期较短，适于 HYPERLINK /item/%E7%9E%AC%E6%97%B6%E8%A1%A8%E8%BE%BE \t _blank 瞬时表达研究。可用同位素、 HYPERLINK /item/%E8%8D%A7%E5%85%89%E7%B4%A0 \t _blank 荧光素和 HYPERLINK /item/%E9%85%B6%E8%81%94%E5%85%8D%E7%96%AB%E5%90%B8%E9%99%84%E6%B5%8B%E5%AE%9A \t _blank 酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbantassay，ELISA）检测其活性，也可进行蛋白质印迹（Westernblotting）和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。 检测方法：1. 转染后 24~72 h，用 D-PBSA 液洗涤细胞。2. 将培养板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。3. 将培养板-70℃ 冷冻 2 h。4. 于 37℃ 下解冻培养板，然后将其置于冰上。5. 将细胞裂解物移至微量离心管中，以最大速度离心 5 min。6. 收集上清液，65℃ 加热 10 min，以灭活 CAT 抑制物质。7. 最大速度离心 3 min 后收集上清液（细胞裂解物），将上清液保存在-70℃。8. 从每一样品中取 5~150μL 细胞裂解物，移至一个 3.5 mL 多聚丙烯闪烁杯中，并且加入足够的 0.1mol/L Tris，终末体积为 150μL。9. 设空白杯，加入 150μL 0.1mol/LTris 液，作为阴性对照。10. 阳性对照：（a）取 5 个闪烁杯，各加入 150μL 0.1mol/LTris。（b）将 5μL 的 CAT 标准液加入到每个闪烁杯中，绘制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 标准曲线。11. 在所有样品杯（包括对照）中，加入 100μL 以下混合液：（a）84μL 超纯水（b）10μL 0.1mol/LTris（c）1μL 的氯霉素（d）5μL（50nCi）的?14C-CoA12. 拧紧杯盖，于 37℃ 下孵育 2 h。13. 向所有闪烁杯中加入 3 mL Econofluor，拧紧杯盖。14. 上下倒置混匀闪烁杯中成分。15. 室温下孵育 2 h。16. 在一个液闪计数仪上测定 30