限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建.PPT

* DNA 的功能主要是貯藏遺傳訊息，而其最重要的生化性質，就是兩股核酸長鏈以加熱方式分開，是為變性。兩股核酸分開後的最大觀察，就是鹼基全部暴露出來，而鹼基在紫外線 260 nm 附近，有強烈的吸光，稱為核酸變性的 hyperchromic effect。 加熱變性後的核酸，若慢慢回復室溫，則兩股核酸上的鹼基，會自行尋找正確配對，因而捲繞回原來的雙螺旋構造，稱為復性。 核酸的變性復性現象與蛋白質很相像，但並非所有的蛋白質分子都可以正確復性，核酸卻可以相當正確地找回原來的配對，但回復溫度的速度不能太快，以免失去正確性。 * 若把 DNA 逐漸加溫，分子間的活動力越來越大，也越難維持兩股間的吸引力，當到達某一溫度後，兩股一下子分開來，期間的鹼基對全部外露，會增加此 DNA 對紫外光的吸收能力，稱為 hyperchromic effect。其實兩股 DNA 間的吸引力還算相當強，因此不到一定溫度，兩股不會散開來。而每一種 DNA 兩股間吸引力大小不同，各有其特定的解開溫度，稱為 Tm (melting temperature)，是每種 DNA 的特有性質。 对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对DNA溶液的紫外吸光率作图，得到的典型DNA变性曲线呈S型如上图所示。 可见， DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度(Tm,melting temperature)。在Tm时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm值与其G＋C所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为： * 一定条件下(相对较短的核酸分子)，Tm值大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；另外，溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽，反之亦然，因此DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。 * 為何 每種 DNA 的 Tm 都不一定相同？ 因為兩股間吸引力大的，其 Tm 會比較高；而兩股間的吸引力為何有大小之別？ 那是因為兩種鹼基對中，AT 之間只有兩個氫鍵，而 CG 間有三個氫鍵，因此 GC 含量越多的 DNA，Tm 就越大。 * 除了 GC 含量會影響 Tm 外，溶液中的離子濃度也有很大影響。 若溶液的離子濃度低，則 DNA 的 Tm 也會降低；因離子可中和兩股 DNA 分子上的強大負電基團 (磷酸)，若離子濃度太低，則兩股磷酸負電無法有效中和，因而造成互斥致使 Tm 下降。因此，請注意在做實驗時，不要把 DNA 溶在純水中，沒有離子的中和，兩股 DNA 可能會互斥，造成變性而沉淀。RNA 則無此問題，為什麼？ * DNA片段越大，复性越慢； DNA浓度越大，复性越快。 * 若 把各種生物的基因體取出，經變性分開兩股後，再慢慢降溫復性，則可發現各種生物復性所需要的時間不同；可以預測越複雜的基因，其復性時間越長，上圖結果的確支持此一想法。圖中的 C0t 代表測試核酸的濃度 (C0) 與復性所需時間 (t) 的乘積，通常若核酸濃度固定，則只需考慮時間，因此橫座標就直接看成時間。每一條曲線，由左上到右下方看，顯示復性的比例越來越多 (1.0 代表全部都復性成功)，而以其中點 (0.5) 作為測量的根據。 P352 图5-22，不同DNA的复性动力学曲线。 * 变性（NaOH 0.5mol/L） 转膜（NC膜，尼龙膜） 固定（80℃，4-6h） 杂交（高盐浓度，68℃，几小时） * 核酸 變性後可再黏合復性，回復原來的雙股核酸。若取兩種不同來源的核酸，經變性後混合在一起，假如兩種核酸的序列同質性高，則可能會雜合為混成的雙股核酸。 也可使用已知序列的核酸小片段，作為探針 (probe) 與 DNA 雜合；一般可先把樣本 DNA 經電泳分離後，轉印至尼龍膜上，再以放射性探針進行雜合，稱之為 Southern hybridization。 RNA 也可以在電泳後，與其互補的 DNA 序列雜合，則稱為 Northern hybridization。 例如，一段天然的DNA和这段DNA的缺失突变体(假定这种突变是DNA分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓起小泡。测定小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多少。 * Southern blotting 的轉印方法： (1) 將核酸以洋菜電泳分離開來；(2) 利用毛細作用把電泳片上的核酸色帶轉印到尼龍膜上；(3) 取下轉印膜並使核酸變性；(4) 加入放射性探針進行雜合反應；(5)