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第二章 发酵工业常用微生物及其培养 2.1 微生物分布 一、微生物类群 目前已经知道的微生物约有10万种，分布在以下各界中： 原核生物界：例如细菌、蓝藻　　√ 真菌界：例如酵母菌 √ 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒 二、微生物生布 人体微生态中微生物的含量 空气中的微生物 各种球菌、芽孢杆菌、产色素细菌以及对干燥和射线有抵抗力的真菌孢子等。也可能有病原菌及少量酵母菌，粘液菌等。 土壤微生物 主要有细菌，放线菌、霉菌，藻类等。 2.2 发酵工业常用菌种 一、生产中常用菌种的分离和选育 野生型菌株通常不能满足需要，因此要通过选育得优质、高产菌株。 二、分离菌种的通常步骤 样品采集→富集培养→纯种分离→性能测定 (1)样品采集 从自然界筛选：空气样品、土壤样品、植物样品、腐烂的水果蔬菜等。 1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 2、采样季节 以温度适中，雨量不多的秋初为好。 3、采土方式 在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 (2) 富集培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 富集方式:摇瓶培养 (3) 纯种分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。 (4)生产性能测定 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过摇瓶进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。 2.3 菌种选育 一、自然选育 微生物在没有人工参与的情况下发生的突变。 影响因素可能有：辐射、互变异构效应 二、诱变育种 人工采取物理、化学或生物的方法促使微生物发生突变的方法。 诱变育种一般步骤: P13图 2-1 (1) 诱变剂的种类及剂量及诱变时间的选择 如：紫外线诱变时应摸索紫外线的强度、照射时间与诱变效果间的关系。 (2) 菌落形态与生产性能间的关系 高产菌种的菌落形态可能与普通菌种的形态不同，如颜色、菌落光滑度、菌落大小等。 三、杂交育种 通常过程: 三、转化和转导 四、原生质体融合 菌种筛选方案 初筛：目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。 复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。 菌种筛选的手段 初筛 √ 从菌体形态变异分析 √ 平皿快速检测法?具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等 √ 摇瓶培养法 摇瓶培养法也可用于初筛。?初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。 特殊变异菌的筛选方法 营养缺陷型突变株的筛选 ?经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。 抗性突变菌株的筛选 抗性突变菌株的筛选 ?抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10-6频率的突变体存在，就容易筛选出来。 2.4 菌种保藏 一、保藏方法 斜面菌种保藏 矿物油保藏 载体吸