实验十五、、表达载体的构建.pptVIP

实验十二、表达载体的构建及鉴定 基因工程中使用的表达系统类型 一、基因来源： 原核生物 真核生物 二、原核表达系统 1、原核表达系统： 遗传背景清楚，易改造，培养容易，费用 低，蛋白质表达水平高。但在原核中表达后所合 成的蛋白无自我修饰如糖基化等，或因折叠的方 式不正确或折叠效率的低下，最后产生的蛋白质 其生物活性很低。 2、真核表达系统 原核表达载体 克隆载体: 通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标 记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。 表达载体: 除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位点(核糖体结合位点,又称SD序列，它是指mRNA分子中核糖体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面3～12个碱基，该序列与16S rRNA的互补)、转录起始信号、转录信号、翻译起始密码子(ATG)和终止密码子等一系列调控序列。 原核表达系统类型 大肠杆菌表达系统 遗传背景很清楚，基因操作的方法非常完善，很容易大规模培养产生大量的目的蛋白质。 但大肠杆菌表达的蛋白质大多不分泌到细胞体外，如要使蛋白分泌到细胞外，必需使目的基因带有信号肽。信号肽(signal peptide)又称前导肽(1eader peptide)，这是一种位于分泌蛋白质或输出蛋白质N端上长约15～30个氨基酸的序列，可被细胞的蛋白质加工机制所识别，使蛋白质通过细胞膜被分泌出来。 枯草杆菌表达系统 真核表达系统类型 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫杆状病毒表达系统 植物细胞表达系统。 真核表达系统类型需要有强启动子、增强子、连接序列（内含子）、转录起始信号、转录信号、多聚A信号、翻译起始密码子(ATG)和终止密码子等筛选标记等。 大肠杆菌表达系统 融合型原核表达载体 非融合型(天然蛋白质）原核表达载体 pGEMEX-1载体图谱（融合型） pET-5a载体图谱（非融合型） 融合型原核表达载体 表达融合蛋白有下列优点： (1)转录和翻译起始从正常的E. coli序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白。 (2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定。 (3)产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋白质凝胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作为抗原。 (4)有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外，这有助于蛋白质的分离和纯化。 非融合型(天然蛋白质）原核表达载体 通常天然蛋白表达载体（非融合型表达载体）都含有一个强的可调控的启动子和一个有效的核糖体结合位点。 大多数原核基因中都带有一个有效的核糖体结合位点，对这些带有强核糖体结合位点的原核基因，只须提供一个启动子； 而对被表达的真核基因(或带有弱核糖体结合位点的原陔基因)，就必须同时提供一个强启动子和一个有效的核糖体结合位点。 选择表达载体应考虑的因素 (1). 所表达的蛋白质是融合蛋白还是天然蛋白。如果是天然 蛋白，必须考虑如何将目的准确地与载体衔接。如果是融合蛋白，载体是由一系列3种不同阅读框架的载体组成，当用同一种限制酶切割载体并与目的DNA片段重组时，则可以保证其中至少有一种融合蛋白的框架与之吻合. (2). 被表达的基因是原核基因还是真核基因。原核基因一般都带有核糖体结合位点，只虑它是否带有强启动子。对真核基因除考虑该基因是否带有启动子、核糖体结合位点外，考虑该基因是否会产生翻译后加工，以后是否需要转到真核表达系统中表达等。 (3). 表达蛋白是否分泌到体外。如需要分泌，则必须带有信号肽序列，故应选择带适当序列的载体。 选择表达载体应考虑的因素 (4).所产生的融合蛋白是否需要切割加工以及如何切割 加工。对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载体 序列间应有适当的切割识别序列。 (5).是否需要用强启动子提高表达水平。当需要提高表 达水平时，可选用强启动子。但在某些情况下，由 于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主不 利，可选用诱导型载体，只有经诱导后，蛋白质才 能被表达。 三种不同阅读框架图例 目的基因的表达产物检测 A．重组载体的构建：将目的DNA片段与表达载体连接，产生阅读框架对应的融合. B．转化：将重组后pGEMEX-1载体转化E.coli JMl09，然后涂布于含氨苄青霉素 (100?g/m1)的LB平板上，在37℃下培养过夜。筛选能在平板上生长的转化子。 C．转化子鉴定: 将转化子挑出后