化学发光免疫印迹技术指引和试验方案-ThermoFisherScientific.PDF

技术指南 化学发光底物 化学发光免疫印迹技术指南和实验方案 简介 化学发光免疫印迹的类型和影响因素 免疫印迹是一种功能强大的常用技术，可用于鉴别并定量复杂 辣根过氧化物酶(HRP)是Western blot 中最常用的酶，在本文 混合物中的特定蛋白。该技术最初由Towbin et al.建立，能够 中会作为示例通篇讨论。最常用的HRP底物基于鲁米诺，可生 实现对固定于硝酸纤维素膜或PVDF膜上的蛋白质样本的间接 成化学发光信号。化学发光的原理是化学反应过程中生成的 检测。在常规免疫印迹流程中，首先通过SDS分离蛋白 能量以光的形式释放。在HRP和过氧化物缓冲液的作用下，鲁 质样本，然后在电场作用下转移至膜上。封闭后，使用靶向目 米诺氧化并形成激发态产物，发出光线的同时逐渐衰变为基 的抗原的一抗(单克隆或多克隆)检测膜。漂洗后再使用靶向一 态。因为只有在酶-底物反应过程中发射光线，一旦酶附近的 抗的酶标二抗孵育膜。酶的活性，例如碱性磷酸酶(AP)和辣根 底物耗尽，信号输出就会停止。相比之下，显色底物(如DAB)生 过氧化物酶(HRP)，是生成信号所必需的。最后，再次漂洗膜， 成的沉淀即便是在反应终止后仍在膜上可见。我们介绍了几 TM TM 使用适当的酶底物进行孵育，即可生成可采集的信号。 种最常用的Thermo Scientific SuperSignal HRP和Pierce ECL化学发光底物(表1)，它们均可用于化学发光免疫印迹检 该指南介绍了使用化学发光底物进行免疫印迹检测的通用 测，具备不同的灵敏度水平，可依据靶蛋白丰度、包含靶蛋白的 方案和影响因素。文中采用了相关的Thermo ScientificTM 和 样品浓度、所需的灵敏度和检测仪器进行选择。 TM Invitrogen 蛋白质研究产品作为参考，但所述的策略和方法 适用于大多数增强型化学发光(ECL)分析与检测。 表1 Thermo Scientific Pierce ECL和SuperSignal系列化学发光底物 SuperSignal™ Pierce™ ™ ™ ™ ECL Pierce ECL Plus West Pico PLUS SuperSignal West SuperSignal West   substrate substrate substrate Dura substrate Femto substrate 检测灵敏度 低至中皮克 低皮克 高飞克 中飞克 低飞克 信号持续 0.5–2 小时 5 小时 6–24 小时 24 小时 8小时 时间 X 光胶片、CCD X 光胶片、CCD 成像 X 光胶片、CCD 成 X 光胶片、CCD 成 X 光胶片、CCD 成 检测方法 成像仪 仪 荧光成像仪 像仪 像仪 像仪 、 靶点丰度较低 样