电离辐射的分子生物学效应.pptx

电离辐射的分子生物学效应;电泳及测序;;第一节 DNA分子和染色质的基本性状及分析手段;DNA是电离辐射的重要靶分子;DNA双螺旋结构;Rosalind Franklin（1920～1958）;DNA分子组成与分析;碱基;脱氧核糖和核糖;核苷;核苷酸;多核苷酸 ; DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等都需要电泳完成。根据分离DNA大小及类型的不同； 琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因凝胶浓度不同而异，胶浓度为0.5~0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp~50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察。并且可观察的DNA条带浓度为纳克级； 原理：DNA在泳动时的分子筛效应和电荷效应，可达到分离混合物的目的。DNA在高于其等电点的溶液中带负电，向阳极移动，其迁移速率与其相对分子量成反比。 DNA的等电点为4～4.5;分子筛效应和电荷效应;质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构形，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。;质粒提取原理;溴化乙锭 (Ethidium Bromide);Health Hazard;DNA测序——双脱氧链末端终止法;DNA测序——双脱氧链末端终止法;DNA测序——双脱氧链末端终止法改进（毛细管电泳）;染色体结构;从DNA到染色体;从DNA到染色体;核小体结构(Nucleosome) ;第二节 DNA损伤类型、检测手段和修复机制; 间接作用：DNA周围其他分子（主要是水分子）吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基，这些自由基可以扩散到足够远，到达并损伤DNA，引起DNA的结构功能破坏。;（一）碱基损伤; Dizdaroglu M等人的工作表明：羟自由基“喜好”攻击嘧啶碱的 5、6位，腺嘌呤的8位， 鸟嘌呤的4、5、8位。鸟嘌呤C-8位易受到羟自由基及单线态氧的攻击而发生羟化，生成加合物8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）;8-羟基脱氧鸟苷检测方法;生物素-亲合素系统;碱基切除修复(BER) ;糖苷水解酶切割N-beta-糖苷键形成无碱基位点（Abase sites）,糖苷水解酶具有特异性，一种酶对应一种损伤类型；;;AP位点检测;（二）DNA链断裂;1. DNA单链断裂损伤 （DNA single strand breaks SSBs）;2. DNA双链断裂损伤 （DNA double strand breaks DSBs）;;Ku70/80;pT2609;同源重组修复(HR);DNA双链断裂损两条修复途径相互竞争;Angelina Jolie;DNA断裂的检测方法：;组蛋白变体 (Histone Variant);γH2AX聚焦点 (foci);Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;MRN-ATM-γH2AX-MDC1反馈环路放大DNA损伤信号;;;单细胞凝胶电泳分析;单细胞凝胶电泳分析应用; 原理 脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一种分离大分子 DNA 的方法。PFGE是采用两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。 ;示意图; 具体步骤： ; 具体步骤： ; ;（三）DNA交联;（1）链内交联;环丁烷嘧啶二聚体; NER主要修复那些影响染色质结构的DNA损伤，包括由紫外线所导致的双嘧啶键结（purimidine dimer），化学分子如cisplatin导致的DNA-DNA链间交联等； ; DNA损伤的感应器为XPC蛋白，XPC蛋白可以结合到DNA双螺旋不稳定区域（无法形成双链），但不与错配碱基结合；;转录偶联修复（TCR）;色性干皮病( xroderma pigmentosa XP)患者;　DNA交联损伤的检测和修复主要由一组FA (Fanconi anemia)蛋白来完成。FA蛋白得名于一种罕有的常染色体遗传病； 　范可尼贫血症，在范可尼贫血症的病人中FA蛋白以各种突变体形式存在，因而导致DNA交联损伤无法得到修复； 　患有范可尼贫血症的病人会在年幼时发病，出现严重的再生障碍性贫血症状，癌症，以及多发性先天畸形； 　FA蛋白包括分别由FANC-A，B，C，E，F，G，L和M组成的FA核心复合体以及FANCI和FANCD2组成的ID