课件：酶的分离与纯化.ppt

蛋白质在水溶液中可因这些亲水基团的电离而带有电荷。在酸性溶液中，羧基的电离受抑制，而氨基可与质子（H）结合成正离子。在碱性溶液中，羧基上的（H）可与氢氧根结合成水，使蛋白质带负电荷。蛋白质的这一性质叫两性电离。 如果在某一pH时，蛋白质电离成正离子或负离子的程度相等，即蛋白质分子的净电荷为零。则称此pH值为蛋白质的等电点（PI）。 蛋白质的等电点与其分子结构有关。不同的蛋白质由于其分子结构不同而有不同的等电点。如果要分离一组等电点不同的蛋白质，只要选择一个合适的pH，使各种蛋白质在该PH时的净电荷差异最大，就可以用电泳方法达到满意的分离效果。 2、电泳的分类 根据被分离样品的多少，可分为分析电泳及制备电泳。 根据电泳电压的高低，分为高压电泳及常压电泳：常压电压一般在600v 以下，电位梯度为2-10v /cm。 根据是否使用支持介质，分为自由电泳，区带电泳。 自由电泳：不用支持介质，电泳在溶液中进行。 区带电泳：使用支持介质，应用广泛。根据支持介质的不同，又可分为滤纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖凝胶电泳以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 根据电泳系统的组成是否均一，分为连续电泳，不连续电泳。 连续电泳：整个电泳系统使用相同的支持介质和缓冲液。 不连续电泳：电泳系统使用不同的支持介质（包括凝胶的浓度与孔径等）和不同的缓冲液（包括缓冲液的组成与pH等）。 3、常用电泳技术 醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。 该薄膜对蛋白质样品吸附性小，又因膜的亲水性小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 醋酸纤维素薄膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后，可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描、测定和膜的长期保存。 过程：膜预处理 加样 电泳 染色 脱色与透明 检测 琼脂糖凝胶电泳 用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳。琼脂糖是从琼脂中分离得到的一种多糖，占琼脂含量的80%，是一种优良的电泳材料，广泛用于同工酶，血浆脂蛋白分离，也可用于免疫电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1）聚丙烯酰胺凝胶的聚合：聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰氨（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（BIS）通过化学催化或光催化聚合成三维立体空间的多聚物。化学聚合的催化剂常用过硫酸铵。为加速反应，需加TEMED-四甲基乙二胺作为加速剂。催化反应需碱性环境，如pH为8.3，丙烯酰胺的浓度为7%，30min就可聚合完毕。 2）聚丙烯酰胺凝胶的孔径与机械强度 聚丙烯酰胺凝胶的分离效果与凝胶孔径有关，凝胶孔径由凝胶总浓度和交联度决定。凝胶总浓度T（g/dl）表示100ml凝胶中丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总克数。T值越大，孔径越小。交联度C表示交联剂BIS占凝胶总浓度T的百分比。C值越大，孔径越小。 3）聚丙烯酰胺凝胶的高分辩率主要归结于以下3种效应 （1）浓缩效应：导致蛋白质样品被压缩为一个薄层。 （2）分子筛效应：凝胶有一定的孔径，不同的蛋白质通过凝胶时受到不同的阻力。小分子受到的阻力小，跑在前面；大分子受到的阻力大，跑在后面。 （3）电荷效应 SDS—PAGE电泳 SDS又叫十二烷基硫酸纳，是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质分子带上大量SDS阴离子（负电荷），大大超过了蛋白质原有的电荷，从而掩盖了各种蛋白质原有的电荷差异（可近似认为各种蛋白质分子带电荷相等）。因此，蛋白质的电泳迁移率仅仅反映了各蛋白质分子量的差别。分子小，电泳时跑得快，分子大，电泳时跑得慢，因而能将分子量不同的蛋白质分开。 SDS—PAGE是测定蛋白质分子量的最好方法。 四、酶的浓缩（concentration） 蒸发 胶过滤 超滤 反复冻融 PEG浓缩 冻干 冻干机 五、酶的结晶（crystallization） 第四章 思考题 1、细胞破碎的方法有哪些？简述其特点。 2、发酵液预处理的目的？主要去除哪些物质？ 3、盐溶、盐析、双水相萃取法、超临界流体萃取法、膜分离、透析、超滤 4、酶提取中涉及哪些技术方法？ 5、盐析法的机制？ 6、盐析法常用中性盐？ 7、盐析法最常用的无机盐是什么？有何优缺点？哪些因素影响其盐析效果？简述盐析的基本操作过程。 8、有机溶剂沉淀法的机理？有何优缺点？常用的有机溶剂？ 9、比较膜分离技术特点。在酶分离纯化中常用哪些膜分离技术？ 10、在酶的分离纯化