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课件:临床试验工作小结.ppt
产 品 临 床 试 验 工 作 小 结 苏州旷远生物分子技术有限公司 技术支持 刘远泽 《基础分子生物学》中的几个概念 1/ 分子生物学(molecular biology): (广义)在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程,比如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。 (狭义)范畴偏重于核酸(基因)的分子生物学,主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。 2/ 核酸(nucleic acid): 是生物体细胞内一类重要的生物大分子。其主要生物学功能是作为遗传信息的载体。 核酸以核苷酸(nucleotide)为基本结构单位,通过3’,5’-磷酸二酯键形成的链状多聚体。 核苷酸由戊糖(核糖)、磷酸、含氮碱基三部分构成。 核酸分类: 脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid,DNA) 核糖核酸 (ribonucleic acid,RNA) 碱基: 嘧啶碱:T、C、U 嘌呤碱:A、G 核糖: D-2-脱氧核糖(D-2-deoxyribose) D-核糖(D-ribose) DNA的结构: 一级结构:(共价结构) DNA分子中的核苷酸排列顺序 / 碱基排列顺序 二级结构:(双螺旋模型)主链、碱基配对、螺旋参数、大沟和小沟 高级结构:(超螺旋结构)正超螺旋、负超螺旋 3/ 染色体的组装(真核生物) 4/ 染色体组 产品临床试验工作可分为五方面: 一、工作前的计划与准备:试验方案拟定与试验用品的准备; 二、试验样本准备:人全血基因组DNA提取及信息整理; 三、试验样本检测:RT-PCR检测及结果分析; 四、工作流程中问题的发现、交流与解决; 五、收尾与总结。 一、工作前的计划与准备 种类与数量 试验用品的准备: 1、试剂盒: 基因型检测试剂盒:反应液/反应酶/质控品 血液基因组DNA提取试剂盒 2、耗材: 移液器(枪):1000 ul / 200 ul / 50 ul / 10 ul / 2 ul(白色长尖) 吸头(枪尖):20 ul (白色长尖)/ 200 ul (黄色)/ 1000 ul (蓝色) 吸头盒(三种规格) 荧光PCR管(长且不透明、8联排)和盖子 Eppendrof 管(1.5 ml) 多空板(96孔 / 60孔)、样本储存盒(72孔)、Marker 笔、手套 3、样本信息对照表 二、试验样本准备:人全血基因组DNA提取 节奏与程度 提取前的检查与准备: 1、检查试剂盒各溶液,若产生沉淀,须在室温放置一段时间,必要时可在37℃ 水浴预热; 2、依据提取步骤,为溶液编号; 3、缓冲液GD和漂洗液PW 需加入适量无水乙醇; 4、剪去吸附柱的盖子 提取步骤: 1、第二次加入细胞裂解液CL(裂解红细胞)时,需要剧烈振荡,以充分混匀沉淀(可见管中液体深红,并有较多泡沫,管底无结块沉淀); 2、加入缓冲液GB后,充分颠倒混匀(如不充分,可能会产生白色沉淀,一般37℃放置时会消失,不影响后续试验); 3、56℃水浴时间延长至30 ~ 40 min,其间颠倒混匀数次,观察溶液是否变得清亮,并为收集管编号(如未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少、纯度不加,直接影响荧光检测); 4、水浴后加入200 ul 无水乙醇,出现絮状沉淀,轻柔颠倒混匀(此时DNA析出,故自此步骤开始,颠倒要轻柔缓慢,否则破坏DNA结构); 5、最后向吸附膜中间位置悬空滴加100ul 超纯水。 三、试验样本检测:RT-PCR检测及结果分析 精细、顺序、安全 RT-PCR前的准备: 1、超净工作台紫外光灭菌; 2、从 -20 ℃取出扩增反应所需的反应液和质控品,置于室温溶解,涡旋混匀约 10 s,离心待用(可使试剂充分溶解混匀,避免因体系溶质不均匀影响反应); 3、准备荧光PCR八联排管(白色/长管 — 长管与ABI 7500仪器符合度较好,利于充分受热,否则严重影响检测结果,导致荧光信号低),并做适当标记; RT-PCR 反应体系的分装与加样: 1、移液器的“连续吸放液”— 调移液器量程至23ul ,将排放按钮按至第一停点(第一档),再将吸头垂直浸入液面,平稳松开按钮,在液面之下,再次将排放按钮按至第一档,排出吸头尖端的气泡后,松开按钮,
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