课件：临床试验工作小结.ppt

产 品 临 床 试 验 工 作 小 结 苏州旷远生物分子技术有限公司 技术支持 刘远泽 《基础分子生物学》中的几个概念 1/ 分子生物学（molecular biology）： （广义）在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程，比如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。 （狭义）范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。 2/ 核酸（nucleic acid）： 是生物体细胞内一类重要的生物大分子。其主要生物学功能是作为遗传信息的载体。 核酸以核苷酸（nucleotide）为基本结构单位，通过3’，5’－磷酸二酯键形成的链状多聚体。 核苷酸由戊糖（核糖）、磷酸、含氮碱基三部分构成。 核酸分类： 脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid，DNA） 核糖核酸 （ribonucleic acid，RNA） 碱基： 嘧啶碱：T、C、U 嘌呤碱：A、G 核糖： D-2-脱氧核糖（D-2-deoxyribose） D-核糖（D-ribose） DNA的结构： 一级结构：（共价结构） DNA分子中的核苷酸排列顺序 / 碱基排列顺序 二级结构：（双螺旋模型）主链、碱基配对、螺旋参数、大沟和小沟 高级结构：（超螺旋结构）正超螺旋、负超螺旋 3/ 染色体的组装（真核生物） 4/ 染色体组 产品临床试验工作可分为五方面： 一、工作前的计划与准备：试验方案拟定与试验用品的准备； 二、试验样本准备：人全血基因组DNA提取及信息整理； 三、试验样本检测：RT-PCR检测及结果分析； 四、工作流程中问题的发现、交流与解决； 五、收尾与总结。 一、工作前的计划与准备 种类与数量 试验用品的准备： 1、试剂盒： 基因型检测试剂盒：反应液/反应酶/质控品 血液基因组DNA提取试剂盒 2、耗材： 移液器（枪）：1000 ul / 200 ul / 50 ul / 10 ul / 2 ul（白色长尖） 吸头（枪尖）：20 ul （白色长尖）/ 200 ul （黄色）/ 1000 ul （蓝色） 吸头盒（三种规格） 荧光PCR管（长且不透明、8联排）和盖子 Eppendrof 管（1.5 ml） 多空板（96孔 / 60孔）、样本储存盒（72孔）、Marker 笔、手套 3、样本信息对照表 二、试验样本准备：人全血基因组DNA提取 节奏与程度 提取前的检查与准备： 1、检查试剂盒各溶液，若产生沉淀，须在室温放置一段时间，必要时可在37℃ 水浴预热； 2、依据提取步骤，为溶液编号； 3、缓冲液GD和漂洗液PW 需加入适量无水乙醇； 4、剪去吸附柱的盖子 提取步骤： 1、第二次加入细胞裂解液CL（裂解红细胞）时，需要剧烈振荡，以充分混匀沉淀（可见管中液体深红，并有较多泡沫，管底无结块沉淀）； 2、加入缓冲液GB后，充分颠倒混匀（如不充分，可能会产生白色沉淀，一般37℃放置时会消失，不影响后续试验）； 3、56℃水浴时间延长至30 ~ 40 min，其间颠倒混匀数次，观察溶液是否变得清亮，并为收集管编号（如未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少、纯度不加，直接影响荧光检测）； 4、水浴后加入200 ul 无水乙醇，出现絮状沉淀，轻柔颠倒混匀（此时DNA析出，故自此步骤开始，颠倒要轻柔缓慢，否则破坏DNA结构）； 5、最后向吸附膜中间位置悬空滴加100ul 超纯水。 三、试验样本检测：RT-PCR检测及结果分析 精细、顺序、安全 RT-PCR前的准备： 1、超净工作台紫外光灭菌； 2、从 -20 ℃取出扩增反应所需的反应液和质控品，置于室温溶解，涡旋混匀约 10 s，离心待用（可使试剂充分溶解混匀，避免因体系溶质不均匀影响反应）； 3、准备荧光PCR八联排管（白色/长管 — 长管与ABI 7500仪器符合度较好，利于充分受热，否则严重影响检测结果，导致荧光信号低），并做适当标记； RT-PCR 反应体系的分装与加样： 1、移液器的“连续吸放液”— 调移液器量程至23ul ，将排放按钮按至第一停点（第一档），再将吸头垂直浸入液面，平稳松开按钮，在液面之下，再次将排放按钮按至第一档，排出吸头尖端的气泡后，松开按钮，