课件：聚合酶链式反应.ppt

（3）Ct值与起始模板的关系 ?研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 荧光定量标准曲线 （4）荧光化学 ????荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种： —荧光探针 —荧光染料 TaqMan荧光探针 与目标序列互补的寡核苷酸探针 两端分别标记一个报告荧光基团(荧光素)和一个淬灭荧光基团(淬灭剂)。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 特异性强：具有引物和探针的双重特异性 重复性好：同一标本的Ct值相同 敏感性高：可检测百万分之一个感染细胞或10病毒 DNA分子 线性范围广：定量的动态范围达5-6个数量级，因而 相差较大的DNA起始拷贝数也不需稀释 工作效率高：一次定量96个样品仅需1-2h 但仪器及 配套试剂极其昂贵 实时荧光定量PCR的特点 DNA克隆 4.9 聚合酶链式反应技术应用 利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。 基因的体外诱变 利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。 基因组的比较研究 比较不同物种之间的基因组特征和相似性。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA) 在医学上诊断的应用 现在无认是艾滋病、癌症等遗传性疾病，还是传染性疾病，很多均已建立起了PCR检测技术平台，只需对病人的血液DNA进行一定的PCR反应，就可进行相应诊断，在严格操作条件的情况下比其它方法简便灵敏。 在法医学上的应用 第一类法医学PCR应用是利用上面所述的分子标记多态性即指纹图谱揭示两外或多个生物样品之间的亲缘关系，第二类是上述所述医学论断结论在法医学上的应用，这在确定犯罪嫌疑人、确定当事人亲缘关系等方面具有广泛应用前景。 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求 * * * * ⑤引物的Tm值 Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2 当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。 适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。 实际复性温度选择低于Tm值5 oC。 手工计算： 一般估计： ⑥引物的浓度 一般使用终浓度各0.2?mol/L。 ⑦简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。 引物设计现在多用专业软件 ⑧套嵌引物（nested primers) 1 3 2 4 如Primer5.0等 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失 dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性 （3） dNTP （4）模板DNA 但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量： 不能太多，100?l反应体系中100ng足够。 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 （5） Mg2+ ① 一定范围内提高退火温度； ② 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及 多余的DNA聚合酶参与酶促延伸的机会； ③ 降低引物和酶的浓度可以减少错误引发， 尤其是能减少引物二