课件：动物细胞制药.ppt

高等哺乳动物受体细胞的条件 细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征， 遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 合适的标记 便于转化株的筛选和维持 生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制 便于大规模培养 大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。 安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP） 次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP） 次黄嘌呤核苷（HR） GMP AMP 尿嘧啶核苷一磷酸（UMP） 胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP） 胸腺嘧啶核苷（TR） 嘌呤核苷酸生物合成途径 嘧啶核苷酸生物合成途径 次黄嘌呤磷酸 核糖转移酶 （HPRT） （TK） 胸腺嘧啶 核苷激酶 氨基喋呤（AP） 氨基喋呤（AP） 从头合成途径 补救合成途径 重新合成途径 补救途径 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补。 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补。 常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO/dhFr- ），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞 磷酸钙共沉淀法 将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37℃保温4-16小时此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞； 弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化效率。 电击转化法 将待转化的DNA溶解在受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的 样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。 电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。 脂质体介导法 将待转化的DNA溶液与磷脂混合，在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。 将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融合，DNA随即进入胞质和核内。 利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa细胞。 哺乳动物细胞的物理转化法 利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。 哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因扩增高效表达外源基因 哺乳动物细胞内的基因扩增现象 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因扩增高效表达外源基因 DHFR-MTX高效表达系统 外源基因 dhfr 转染dhfr - 细胞系 单克隆 0.05 mM MTX 培养 5 mM MTX 0.25 mM MTX 外源基因扩增 至100拷贝 培养