琼脂糖电泳法测定多糖的操作规程.pdfVIP

琼脂糖凝胶电泳法测定多糖的操作规程 Protocol of agarose gel electrophoresis for analyzing polysaccharide 实验仪器与材料： 实验仪器： DYCp －3/C 型电泳槽（Electrophoresis chamber ）、制胶槽（gel form ）和梳子（comb, 梳 齿长 1cm） 北京市六一仪器厂（尺寸：11cmX6.5cm）（最大电压600v, 最大电流 200mA ） DYY-5型稳压稳流电泳仪(Electrophoresis power supply) 北京市六一仪器厂 STS-2 型脱色摇床 上海琪特分析仪器有限公司 电子天平 上海精科天平 FA2004 320S pH 计 上海梅特勒－托利多公司 密封式恒温可调电加热器 浙江嘉兴市凤桥电热器厂 微量加样器 (pipette) Gilson 公司 与微量加样器适配的吸头(tip) 购自天津联星生物公司 材料: 1 琼脂糖（Agarose ） 北京奥博星生物技术责任有限公司 BIOWEST AGAROSE (Regular ) Distributed by Shanghai Yito Enterprise Company Ltd. BR 2 巴比妥钠（ Sodium barbital ） 中国医药（集团）上海试剂公司 CP 3 乙二胺（配制电泳缓冲液用， 本实验未选用） 4 甲苯胺蓝 （Toluidine Blue, Dimethyl toluthionine chloride ） UNI-chem Chemical reagent (购自天津联星生物公司) CP 5 冰醋酸（Acetic acid glacial ） 天津科威公司 AR 6 无水乙醇 （Ethanol absolute ） 天津科威公司 AR 7 十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide) 天津市远航化学品有限公司经销 分析专用 8 溴酚蓝（Bromophenol Blue ） 购自天津联星生物公司 ACS Grade 9 甲酚红（指示剂，选用，本实验室未采用） 10 标准硫酸化葡聚糖 Dextran Sulphate 或标准化肝素 Heparin （用于标定琼脂糖电泳凝胶，选用，本实验室未采用） 11 盐酸 (Hydrochloric acid) 天津市大茂化学试剂厂 12 爱茜蓝（Alcian Blue ） 第 1 页 共 12 页 染色剂 13 多糖 由本实验室自行制备 14 乙酸钠(Sodium acetate anhydrous) 天津科威公司 AR (分子量 82.03) 15 胶带 Masking tape, if needed to seal gel form 16 托盘 （尺寸） 17 水 （去离子水，过0.22μ滤膜处理 ） 18 烧杯、量桶等玻璃容器若干 19 记号笔 实验准备 1 按配方 A 配制巴比妥溶液 500mL； 2 按配方 B 配制染色液 250mL; 3 按配方 C 配制脱色液 500mL； 4 按配方 D 配制琼脂糖溶液 15mL; 5 按配方 F 配制 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵溶液)(0.1%)100mL; 6 按配方 G 配制醋酸钠缓冲液 500mL； 5 配制样品溶液（按照具体实验要求配制不同浓度的多糖溶液）； 6 与相关实验人员协调，确定实验时间; 7 检查电泳装置能否正常工作。 操作步骤： 1 在 25mL 巴比妥缓冲液中加入0.150g 琼脂糖，在 80℃下水浴加热或用密封式恒温可调电 加热器加热琼脂糖溶液，使其溶化。 2 将制胶槽(又称胶床)用胶布封闭两端，缓慢灌注溶化的琼脂糖溶液（胶厚约 3.5mm ）， 防止胶面有气泡产生，静置，冷却至少 30min；然后插上梳子，并检查梳孔附近是否有气 泡。 3 倒入少量电泳缓冲液，润湿胶面，然后倾倒掉缓冲液。将梳子缓缓拔出。 轻轻拆去制胶 槽上的胶布，将制胶槽放置于电泳槽内。 4 在电泳槽内注入电泳缓冲液约 200mL