课件：控制兽药残留.ppt

* 间接竞争ELISA－测瘦肉精 * 捕获抗体ELISA －测瘦肉精 * * ELISA小结 基本原理：抗原抗体反应、酶促反应 ELISA应用形式比较灵活，可测定抗原、抗体 ELISA在食安领域应用比较广泛：细菌、病毒、真菌毒素、寄生虫、农药、兽药、有机污染物等 如何建立重金属ELISA方法？ * PCR检测微生物 聚合酶链式反应 ( PCR) ：可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析和定量的分析 。 PCR原理图 3’ 3’ 3’ 变性、退火 延伸 变性、退火、延伸 3’ * * 常规PCR方法的局限性 无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析 必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒 无法对扩增反应实时检测 * 三、辐射食品的检测（了解） 电子自旋共振光谱 热荧光技术 源于脂肪的挥发性碳氢化合物的鉴定 酪氨酸方法 * 四、对辐照食品关注的问题 营养成分损失、有毒物质的产生 辐照食品有无放射性污染 有无感生放射性 公众接受性－心理障碍 * 在商业允许的剂量下处理的辐照食品对食品安全性的影响甚微，对人类健康无任何实际危害 不能因为对辐照技术的恐惧和不了解而阻止辐照技术在食品工业的应用 加强食品辐照技术的宣传，让更多的企业和公众了解辐照技术对食品安全性的影响，消除人们心理障碍，推进辐照技术在食品工业的应用，让辐照技术更好的保障我国的食品安全 小结 * 补充：ELISA 一、免疫学基本概念 抗原：能刺激机体免疫系统启动免疫应答，并能与相应的免疫应答产物在体内或体外发生特异性结合的物质 特性 免疫原性 免疫反应性 * 半抗原：只有免疫反应性，而无免疫原性的小分子物质。如药物、多糖、类脂等。 载体：赋予半抗原具有免疫原性的蛋白质分子，即为载体，通常用的BSA、OVA 注意：制备半抗原抗体，必须首先将半抗原耦联到蛋白质 * 抗原表位或抗原决定簇：指存在于抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。其性质、数量和空间构象决定了抗原的特异性。 * 抗体：B细胞在抗原的刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白，主要存在血清或其他体液中 * 抗体应用形式 多克隆抗体(polyclonal antibody)：由多个抗原决定簇刺激不同的B细胞产生的 单克隆抗体(monoclonal antibody)：由一个B细胞分泌的抗体 基因工程抗体：应用基因工程技术对需要的抗体进行改造所获得的抗体 * 二、抗体制备 （一）多克隆抗体 直接免疫动物，如兔、羊、鼠等，获取血清即可。 产生多种针对不同表位的相应抗体 * （二）单克隆抗体 1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein创造了杂交瘤技术，获得诺贝尔奖 杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞大量无限生长繁殖的特性，又具有抗体形成细胞合成和分泌抗体的能力 特异性强 * * * （三）基因工程抗体 原理：细胞获得编码抗体的基因，或以多聚酶链反应扩增技术基因片段，经体外DNA重组后，转化受体细胞，使其表达特定抗体 如：人-鼠嵌合抗体、双特异性抗体、改型抗体等 嵌合抗体：鼠源抗体的V区和人源的C区重组后可得，保留了抗体对抗原的高亲和力，同时减弱了鼠源抗体的免疫原性。 * * 三、抗体在食安检测中的应用 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA) 试纸条测定——胶体金技术 免疫亲和柱 免疫微球 免疫传感器 联用技术，如PCR-ELISA、ABS-ELISA等 免疫印迹、生物芯片等 * （一）、ELISA基本原理 ELISA的基础：抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的性 * 96孔板 * 基本原理：在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，根据呈色的深浅进行定性或定量分析 * （二）、酶及其底物 酶 底 物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色 492 460 449425642 碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色红色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色深蓝色 405 420 β-Ｄ－半乳糖