质粒的两条链均断裂一试验原理pGEX.ppt

一 实验原理 什么是质粒？ 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。 在pH12.0?12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。 分离质粒DNA有三个步骤： 培养细菌使质粒扩增， 收集和裂解细菌， 分离和纯化质粒DNA。 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒： 共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂； 超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂； 松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂； pGEX-6p质粒载体菌, LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素）， 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I）， NaOH/SDS溶液(溶液 II)