脓汁与粪便标本中病原菌的检测.docVIP

微生物实验报告 实验名称 脓汁和粪便标本中病原菌的检测 实验者 学号 日期 2016-11-25 指导老师 一、实验目的 1、掌握培养基制备的原则和一般方法。 2、掌握病原菌的分离与培养方法。 3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法，熟悉细菌基本形态。 4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。 5、掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。 6、熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用，掌握纸片扩散法。 7、掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。 实验器材 1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、15支试管、试管架、试管筐、5ml刻 度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯。 2、脓汁标本1支，粪便标本1支；碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科镊子2把；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板5个。接种环，酒精灯。 3、斜面4支，空气、手指皮肤、细菌分离培养物（上次实验平板）。 4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1 本，载玻片4张，染色瓶，染色架。 5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4 个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把。 6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。 方法与步骤 流程图： 1、培养基的制备： 培养基 称量干粉培 养基(g) 水量(ml) 煮沸(次） 分装(ml) 备注 营养琼脂 11.4 300 2瓶，500ml锥形瓶，平板 营养琼脂 2.9 75 3 5 15支x3，中试管，斜面 营养肉汤 1.1 50 1 3 15支x3,小试管,肉汤 半固体琼脂 1.7 60 3 4 15支x3，小试管，高层 干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸、牛皮纸，用 橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到髙压蒸汽灭菌室→灭菌（用于倒平板的培养基不用加热溶解，摇匀即可）。 2、细菌的分离培养 1）空气的细菌学检查 每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边，平板暴露于空气中15分钟，然后平板倒扣盖上，作标记。37℃温箱培养24小时，观察结果。 2）手指皮肤的细菌学检查 在普通平板上接种手指上的细菌。上:甲、丙→常规洗手，下:乙、丁→标准洗手。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。 3）平板划线分离法 甲→脓汁标本(pus specimen)→营养琼脂平板(nutrient agar plate) 乙→脓汁标本(pus specimen) →营养琼脂平板(nutrient agar plate） 丙→粪便标本(stool specimen)→伊红美蓝(eosin methylene blue plate） 丁→粪便标本(stool specimen) →伊红美蓝平板(EMB plate） 方法：（1)右手拿接种环（如握笔式)，烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种环杆部分亦要 迅速通过火焰2~3次，以杀灭其表面细菌；（2)左手握住盛有标本的试管的下端，右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出试管棉塞并挟住之，将管口迅速通过火焰三次灭菌；（3)立 即将已灭冷却的接种环伸入试管内，沾取标本（或菌液）一环，试管口火焰灭菌后塞好棉塞; (4)左手斜持平板，略开盖，在酒精灯火焰左前方约5~6cm处，将接种环上的菌液涂抹于平板表面的边缘部分；（5)烧灼接种环，冷却后，从原涂抹部分开始，连续平行划线，每次只划平板的1/4~1/5，划毕后接种环再经火焰灭菌，冷却后用同样方法在平板其余部分划线， 每次划线要与前次划线重叠1-3条，共计3^次（区)；（6)接种完毕，将接种环烧灼灭菌后方可放下；（7)将培养皿倒置，37°C培养34小时后，观察结果。 3、细菌的纯培养 斜面接种分工 甲→普通平板→金黄色菌落(auratus，golden yellow)→1支斜面 黄色菌落可能是空气污染的微球菌、黄色小球菌，不能挑选。 乙→普通平板→白色菌落(albus，white)→1支斜面 丙→ EMB平板→紫黑色菌落(atropurpureus)→1支斜面 丁→ EMB平板→粉红色菌落(pink) →1支斜面 戊→ EMB平板→粉红色菌落(pink)→1支斜面 ※斜面正面上2/3作标记： 组号 + 金黄、白色、紫黑、粉红。→收集平板-灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。 4、细菌的形态学检查 1）革兰染色法 涂片→干燥→固定→染色 (1)涂片→干燥→固定 甲→金黄，紫黑 乙→金黄，紫黑 丙→白色，粉红 丁→白色，粉红 方法：涂片：①接种环取盐水3ulX2滴，水滴