免疫荧光单标记和双标记的方法.docVIP

免疫荧光单标记和双标记的方法 ? ??? l免疫荧光单标记方法 ??? 免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。 ??? 1)所需材料与试剂 ??? (1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。 ??? (2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。 ??? (3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃ ??? (4)封闭液。 ??? (5)0．01mol／LPBS缓冲液。 ? ??2)染色方法 ??? (1)取出培养有细胞的盖玻片或glass—bottom培养皿，用0．01MPBS洗2—3遍。 ??? (2)加入0．3％的TritonX—100，37℃ ??? (3)加入4％多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃ ??? (4)正常阻断血清1：20封闭室温20～30min，抑制IgG的非特异性结合。阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。 ??? (5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃ ??? (6)0．3％TritonX—100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。 ??? (7)加入FITC—二抗或TRITC—二抗，37