梯度洗脱方式.PPT

检测原理：具有某种特殊结构的化合物受紫外光激发后，能发射出比激发光波长更长的荧光，其荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系，通过测定荧光强度来进行定量分析。 适用范围：用于能产生荧光的化合物及通过衍生技术生成荧光衍生物的检测。 3. 电化学检测器 (ECD) 检测原理：一种选择性检测器，依据组分在氧化还原过程中产生的电流或电压变化对样品进行检测。 适用范围：用于测定氧化活性或还原活性物质。已在生化、医学、食品、环境分析中获得广泛用于。 特点：测定的灵敏度较高，检测限可达10-9g/ml。 4. 示差折光检测器 (RID) §14-3-2 高效液相色谱法的应用 其应用范围比气相色谱法广泛。 被分离样品不受沸点、热稳定性、相对分子量大小及有机物或无机物的限制，只要能制成溶液即可分析。 由于具有高选择性、高灵敏度等特点，现已成为医药研究的重要工具，主要用于各种有机混合物的分离分析。 高效液相色谱法的定性、定量分析方法与气相色谱法基本相同。 一、定性分析 分为：色谱鉴定法及非色谱鉴定法。 色谱鉴定法： 利用纯物质和样品的保留时间或相对保留时间相互对照，进行定性分析。 2. 化学鉴定法： 利用专属性化学反应对分离后收集的组分定性。 3. 两谱联用 当组分分离度足够大时，分别收集各组分的洗脱液，除去流动相，用红外光谱、质谱或核磁共振谱等手段鉴定。 二、定量分析 其定量分析方法与气相色谱法相同，常用的有外标法和内标法。 例：复方解热镇痛片（APC）的含量测定 色谱条件：φ2mm×500mm柱； 固定相：YGS-13或日立3010胶； 流动相：乙醇-H2O(24:1)，含1/500三乙醇胺； 流速：1ml/min； 检测波长：UV-273nm。 样品：APC片粉碎后用定量的乙醇密塞浸泡 10~20min，注射上清液。用内标法定量，如图14-3（P268） 据键合固定相与流动相之间相对极性的强弱，键合相色谱法分：正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。 一、正相键合相色谱法 例：分析氨基酸类、胺类、酚类及羟基类等极性/中等极性的组分。 二、反相键合相色谱法 样品中极性大的组分先流出色谱柱，极性小的组分后流出色谱柱。 反相色谱法特点： 柱子使用寿命长：固定相不易流失。 流动相可灵活选择：流动相多以水作基本溶剂，然后再适当加入能与水互溶的有机溶剂，可使流动相的极性灵活多变，对更换溶剂或梯度洗脱非常方便。 应用范围特别广泛：既可分离非极性至中等极性的各种分子型化合物，又可分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。 §14-2-3 流动相的要求和洗脱方式 一、流动相的要求 1. 流动相的基本要求 2. 流动相的处理和贮存 流动相在使用前要经过一定的处理，以满足分析的要求。 纯化 流动相在使用前必须经过0.45um滤膜过滤，以除去溶剂中的微小机械杂质，防止输液管道和进样阀堵塞。 2. 脱气 流动相中常溶解有一些气体，会给检测过程带来不良影响(P264)，使用前必须进行脱气处理。 方法：抽真空脱气法、加热回流脱气法、超声波震荡脱气法等。多组分的流动相，通常采用超声波震荡脱气15~20min。 3. 贮存 最好现配现用，一般贮存于玻璃、不锈钢或氟塑料容器内，必须密闭贮存，防止流动相蒸发及空气中氧气和二氧化碳的溶入。 二、洗脱方式 1. 恒定组成溶剂洗脱 最常用的洗脱方式是：采用恒定组成及配比的溶剂洗脱。 对于成分复杂的样品，难以获得理想的分离效果。 2. 梯度洗脱 在同一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的配比。 (1) 注意事项： 1. 梯度洗脱过程中使用多种溶剂混合，要求所用溶剂互溶性好、纯度高，以保证重现性。 2. 混合溶剂的黏度随流动相组成而变化，在梯度洗脱过程中应防止压力超出输液泵或色谱柱的最大承受压力。 3. 每次梯度洗脱结束后，必须对色谱柱进行再生处理，使其回复到初始状态。 (2) 应用及特点： 广泛应用于分离复杂样品。 优点：1. 缩短分析周期；2. 提高分离效能；3. 改善色谱峰形；4. 增加灵敏度。 缺点：有时易引起基线漂移。 (3) 梯度洗脱方式： 1. 高压梯度或内梯度 梯度洗脱由一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同性质的溶剂按一定的