基因工程上课-文档资料.pptVIP

基 因 工 程;基因重组(DNA重组):将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而形成新的DNA分子的过程; 基因工程的概念： 利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.;基因工程(gene engineering)常和以下名称混用; 1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。 2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子 3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。 4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。 5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 ; ; 2019年7英国爱丁堡罗斯林（Roslin）研究所用药物促使母羊排卵，将卵吸空，制成空卵壳，再从母羊乳腺中取出一个体细胞，使它与卵壳合成一个含有遗传物质的卵细胞。当卵细胞分裂形成胚胎后被植入母羊子宫内，母羊产下了与自己有相同基因的多莉！ ;第一节　重要的工具酶;一、限制性核酸内切酶;⒉限制酶的命名;⑴粘性末端;⑵平末端： 切割点是识别序列的对称轴，产生平端或钝端(blunt end)。 如SmaⅠ;BamHⅠ;⑶特殊性质的Ⅱ型限制酶：;又如KpnⅠ和Asp718Ⅰ的识别位点相同，但切割位点不相同，前者产生3粘性末端，而后者产生5粘性末端;同尾酶(isocaudarner)：有些限制酶的识别序列不同，但是它们作用后产生相同的粘性末端，故称为同尾酶。 例如MboⅠ、BamHⅠ、BglⅡ的识别切割序列分别为：;二、DNA聚合酶;(二)Klenow片段;;补齐双链DNA的3ˊ末端。 5ˊ-G-OH Klenow 5ˊ-GTTAA-OH 3ˊ-CAATT-OH dATP,dTTP 3ˊ-CAATT-OH ;(三)TaqDNA聚合酶;三、逆转录酶;四、DNA连接酶;五、碱性磷酸酶;第二节　基因克隆常用的载体; 外源 DNA一般没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效的方法能将导入了外源 DNA片段的细胞和未导入外源DNA的细胞区分开来。 外源 DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，即没有自主复制能力，达不到使外源DNA片段扩增的目的。 ; 如果要将外源 DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有一个能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的载体来携带。外源DNA片段与载体在体外连接，构成重组分子，然后导入宿主细胞，使之进行扩增或表达。 ;一、载体的分类;;(二)表达型载体(expression vector)： 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。 ◆表达型载体除具有克隆载体所具有的特性外还具备表达系统元件 ◆原核表达载体的表达系统元件是 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号 ◆真核表达载体的表达系统元件是 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-终止信号和poly(A)信号;粘粒(cosmid)(超纯质粒 );(一)质粒;常用质粒载体举例;1、pBR322载体;2、pUC18和pUC19;pUC18和pUC19载体;;第三节　重组DNA基本原理;一、目的基因的获取 (一)制备基因组DNA文库 采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因组文库(genomic library)。用适当的筛选方法从菌落中选出含有某一基因的菌落，再行扩增，将重组DNA分离、回收，获得目的基因的克隆。;基因组DNA文库;(二)制备cDNA文库 以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库(cDNA library) 。采用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。 在细胞中，表达基因一般仅占基因总数的15%左右，所以从mRNA出发分离目的基因极大地缩小了搜索目的基因的范围。;cDNA文库的组建：;(三)聚合酶链反应(PCR) 如果知道目的基因的全序列或