试验06试管直接凝集试验.doc

实验 6 试管直接凝集试验（肥达反应） 【目的】 1．掌握试管凝集试验的原理。 2．熟悉肥达试验的方法、凝集效价的判定及临床意义。 【原理】 试管凝集试验是用已知的颗粒性抗原来检测未知抗体及其相对含量。肥达试验（Widal test）就是用已知的伤寒、副伤寒沙门菌的O和H抗原，检测受检血清中有无相应的抗体的半定量试管内凝集试验。人体感染伤寒或副伤寒沙门菌后，能产生与这些细菌起特异性反应的抗体（凝集素），这种抗体与伤寒或副伤寒沙门菌相混合，在适当电解质参与下出现肉眼可见的凝集现象。本试验是用伤寒杆菌O和H抗原及甲、乙型副伤寒H抗原（以PA、PB表示）与不同稀释倍数的患者血清作试管凝集试验。 【材料】 1．抗原：伤寒杆菌O、H及甲、乙型副伤寒菌液。 2．患者血清（须经56℃30min 3．生理盐水、小试管、吸管、水浴箱等。 【方法】 这里介绍单管稀释法。 1．准备28支小试管，排成4排，每排7支。 2．取中号试管1支，加生理盐水3.8 ml，用吸管吸取患者血清0.2 ml加入其中混匀，即为1: 20稀释血清，总量为4 ml。 3．吸取1: 20稀释的血清2 ml，在每排的第一管中各加入0.5 ml。（这时中号试管中还剩1: 20稀释血清2 ml）。 4．再向上述中号试管中加入2 ml生理盐水，混匀，即为1: 40稀释血清，总量为4 ml。然后吸取此稀释度血清2 ml向每排第二管各加0.5 ml。 5．依次类推将血清不断作倍比稀释，并依次加入各管，直至每排的第六管为止。 6．在各排的第7管中各加0.5 ml生理盐水，做阴性对照。 7．在第一排的各管中加伤寒杆菌O菌液0.5 ml；在第二排的各管中加伤寒杆菌H 菌液0.5 ml；在第三排的各管中加PA H 菌液0.5 ml；在第四排的各管中加PB H 菌液0.5 ml。由于各管均加入0.5 ml菌液，即又被稀释了一倍，所以每排各管中血清的最终稀释度发生了变化。见表6-1。 试验管（每管0.5ml） 对照管 1号管 2号管 3号管 4号管 5号管 6号管 7号管 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 (NS) 第一排 O抗原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 第二排 H抗原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 第三排 PA抗原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 第四排 PB抗原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 血清最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 - 【结果观察】 （一）结果的观察和判断 观察时在斜射光线下透视，观察试管中悬液的混浊程度及管底凝块的多少。先观察对照管，再分别观察各试验管的凝集情况，并与对照管相比较。根据混浊程度及管底凝块的多少，以“++++”、“+++”“++”“+”符号记录。 ++++ ：上清液完全澄清，细菌凝集块全部沉于管底。 +++ ： 上清液澄清度达75%，大部分细菌凝集块沉于管底。 ++ ：上清液澄清度达50%，约50%细菌凝集块沉于管底。 + ：上清液混浊，澄清度仅有25%，管底仅有部分细菌凝集成块沉于管底。 - ：液体均匀混浊，无凝集块。 血清的凝集效价（即滴度）是指能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“++”凝集）的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体的含量，血清效价越高，所含抗体的量愈多。一般认为，伤寒沙门菌O抗体凝集效价在1: 80以上，H抗体在1: 160以上，甲、乙型副伤寒沙门菌凝集效价在1: 80以上才有诊断价值。 （二）结果分析及临床意义 1．首先应考虑当地正常人的凝集效价，凝集效价大于正常效价才有意义。 2．伤寒病人的O凝集素常较H凝集素出现为早，存在于血清内的时间较短，而H凝集素出现较迟，但效价较高，存在于血清内时间亦较长，可达数年。 3．因伤寒H凝集素在血内保持时间较久，而O凝集素较短暂，所以曾接种过伤寒菌苗者，O凝集价在诊断上较重要。 4．曾患过伤寒或曾接种过伤寒菌苗，新近又感染流行性感冒或布氏菌等疾病时，可产生高度的H凝集素及较低的O凝集素，这种反应称回忆反应。 5．确诊为伤寒的患者中，约有10%的患者肥达氏反应始终为阴性，故阴性结果不能排除伤寒的诊断。 6．采血的时间不同，肥达反应的阳性率也不同，发病第一周阳性率为50%，第二周为80%，第四周为90%，恢复期凝集价最高，以后逐渐下降，以至转阴。临床上一般以双份血清（疾病早期和恢复期）的凝集价有4倍增高作为新近是否感染该病的指征。而单份血清的凝集价应达1: 160以上才有诊断参考价值。 7．本试验可用于辅助诊断伤寒及副伤寒沙门氏菌引起的肠热症的辅助诊断。 【注意事项】 1．取样和加样应