植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析研究报告.docVIP

个人收集整理 仅供参考学习 个人收集整理 仅供参考学习 PAGE / NUMPAGES 个人收集整理 仅供参考学习 《分子生物学》实验报告 实验一植物基因组DNA地提取及其定性、定量分析 【实验目地】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析.b5E2RGbCAP 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来.利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞.然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提地方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA.p1EanqFDPw 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段地常用技术.把DNA样品加入到一块包含电解质地多孔支持介质(琼脂糖凝胶)地样品孔中，并置于静电场上.DNA分子在高于等电点地pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应.由于糖-磷酸骨架在结构上地重复性质，相同数量地双链DNA几乎具有等量地净电荷，因此，在一定地电场强度下，DNA分子地迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身地大小和构型.DNA分子地迁移速度与相对分子质量地对数值成反比关系，分子量小地DNA分子比分子量大地DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离.凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同地DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢地为开环质粒DNA(ocDNA).DXDiTa9E3d 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环地共轭双键，在260 nm波长处有特异地紫外吸收峰，其吸收强度与核酸地浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础.1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL，ssDNA 33 μg/mL和ssRNA 40 μg/mL.可以此来计算核酸样品地浓度.紫外分光光度法不但能确定核酸地浓度，还可通过测定260 nm和280 nm地紫外线吸收值地比值(A260/A280)估计核酸地纯度，若DNA地A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染.RTCrpUDGiT 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μL量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套.5PCzVD7HxA 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料.jLBHrnAILg 三、试剂 1. 2×CTAB buffer【1】 70%乙醇【2】 RNaseA (天根)【3】 0.5×TBE缓冲液(工作浓度)【4】 6×loading buffer【5】 6. 核酸染料(赛百盛) 7. DNA marker DL 2000(Takara) 8. 酚/氯仿 (1:1, V/V) 【6】 【实验步骤】 1. 取约100 mg新鲜地拟南芥嫩叶放入1.5 mL EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状. 2. 加入0.6 mL 2×CTAB提取液（用前加入0.2﹪地巯基乙醇），混匀，65℃水浴30 min，每10 min颠倒混匀一次.xHAQX74J0X 3. 取出离心管，冷却后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混匀. 4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次). 5. 将上清液(约400 μL)转移到另一新地1.5 mL离心管中. 6. 加入与上清等体积地氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清(约350 μL). 7. 加入600 μL无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30 min. 8. 4℃，15,800 rpm离心20 min，弃上清. 9. 1 mL 70％乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex，7,000 g离心3 min，弃上清，风干.LDAYtRyKfE 10. 加入30 μL无菌水(含20 μg/mL RNase A)，37℃溶解DNA 30 min. 11. 取5 μL DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测： (1) 制备琼脂糖凝胶 称取0.3 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 mL 0.5× TBE缓冲液