在大肠杆菌中表达酮酸脱羧酶产异戊醇.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（４）：６０６５ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 在大肠杆菌中表达酮酸脱羧酶产异戊醇 １，２ １ １ １ １ 肖仕圆 　许敬亮 　陈小燕 　杨　柳 　袁振宏 （１中国科学院广州能源研究所　中国科学院可再生能源与天然气水合物重点实验室　广州　５１０６４０） （２中国科学院大学　北京　１０００４９） 摘要　酮酸脱羧酶作为异戊醇生物合成的关键酶，不存在于大肠杆菌中。以乳酸乳球菌的基因 组ＤＮＡ为模板，经过ＰＣＲ扩增得到酮酸脱羧酶基因ｋｉｖＤ（ｒｂｓ），插入到大肠杆菌高效表达载体 ｐＥＴ２８ａ（＋）上形成ｐＥＴｋｉｖＤ（ｒｂｓ），重组质粒热击转化进大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，其成功表达了 酮酸脱羧酶。对发酵产物进行分析，检测到了微量的目标产物—异戊醇。 关键词　酮酸脱羧酶基因　重组质粒　转化　异戊醇 中图分类号　Ｑ７８９ 　　全球环境的恶化、能源的不足等问题促进了对可 ［１］ 再生生物燃料能源的研究 。目前，研究的主要热点 方向是生物燃料乙醇，在２０１１年，美国的产量达到了 ［２］ １０亿加仑 。然而，乙醇具有高蒸汽压、腐蚀性等性 质，使其作为汽油代替燃料仍然存在一定的缺陷，异戊 醇等高级醇比乙醇具有更高的能量密度、更低的蒸汽 ［３］ 压、更高的辛烷值等特点，其性质更接近于汽油 ，成 为新一代可再生能源的研究方向。 　　过去一直没有微生物能够经由葡萄糖直接大量合 成异戊醇等高级醇的报道。在２００８年，美国加利福尼 亚大学的研究团队在Ｎａｔｕｒｅ上率先报道了通过非发酵 图１　异戊醇生物合成途径 ［４］ 途径合成高级醇的方法 。他们以氨基酸合成的共同 Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅｐａｔｈｗａｙｆｏｒｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 前体物 酮酸作为底物，在 酮酸脱羧酶和醇脱氢酶 α α Ｋｅｔｏａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ； Ａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ① ② 的作用下生产出异丁醇、异戊醇和２甲基１丁醇等高 级醇（图１）。而大肠杆菌作为研究得最为详尽的原核 　　本研究拟通过增加核糖体结合位点ｒｂｓ优化表达 宿主菌，具有遗传背景清楚、生长周期短、培养条件温 条件，利用大肠杆菌强启动等策略，将乳酸乳球菌的酮 和、代谢易于控制等优点。近年来，研究者利用非发酵 酸脱羧酶基因ｋｉｖＤ通过ＰＣＲ扩增连接到大肠杆菌高 途径，通过相关基因的表达，在大肠杆菌中成功地合成 效表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）上，以实现其高效表达，为今 ［５７］ 后构建高产异戊醇工程菌株奠定基础。 了异丁醇、异戊醇等高级醇 。但由于关键基因酮酸 脱羧酶的低表达量，使其成为了阻碍高级醇大量生产 １　材料与方法 的瓶颈。 １．１　材　料 收稿日期：２０１５０１１４　　修回日期：２０１５００００ 国家自然科学基金２１２１１１４０２３７），国家“８６３”计划 １．１．１　菌株和质粒　本实验使用的菌株、质粒见表１。 （２０１