2019年动物细胞培养技术.pptVIP

动 物 细 胞 培 养 技 术;动 物 细 胞 培 养 技 术;一. 前言; 动物细胞的特点及生长特性: 动物细胞虽可像微生物细胞一样, 在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养, 但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比, 有显著差别 :①动物细胞比微生物细胞大得多, 无细胞壁, 机械强度低, 对剪切力敏感, 适应环境能力差; ②倍增时间长, 生长缓慢, 易受微生物污染, 培养时须用抗生素; ③培养过程需氧量少(氧传质系数kLa 大于10 h - 1即可满足每毫升107 个细胞的生长) ; ④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在; ⑤原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡; ⑥代谢产物具有生物活性, 生产成.本高, 但附加值也高。;一. 固定化动物细胞大规模培养技术;1. 1 　吸附 1. 1. 1 　多孔陶瓷 美国某公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体，可提供4. 25 m2 的生长表面积。既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中, 给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离, 所以不必考虑梯度问题; 当培养基高速循环时, 可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大.;1. 1. 2 　微载体 微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体) , 使细胞在微载体表面附着和生长, 并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面, 1 g 微载体其比表面积可达6 000 cm2 , 从而可实现细胞的高密度培养。; 微载体的直径在60～250μm , 由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成, 如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性, 在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质, 因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。采用微载体培养具有以下优点: ①比表面积大, 单位体积培养液的细胞产率高; ②采用均匀悬浮养, 无营养物或产物梯度; ③可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况; ④细胞收获过程相对简单, 劳动强度小; ⑤培养基利用率高, 占地面积小; ⑥放大容易, 国外已有公司以1 000 L 规模培养人的二倍体细胞来生产β- 干扰素。但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞; 接种密度高; 微载体吸附力弱, 不适合培养悬浮型细胞。;1. 1. 3 　大孔微载体 人们为了解决微载体培养系统中细胞易受机械损伤的缺陷以及能最大限度地扩大比表面积, 开发了具有完全连通沟回的大孔微载体。 大孔微载体将细胞固定在孔内生长, 因而与其他方法相比具有一系列优点: ①比表面积大,是实心微载体的几倍甚至几十倍; ②细胞在孔内生长, 受到保护, 剪切损伤小; ③与包埋法相比, 传质尤其是传氧效果好 ; ④两种类型细胞都适用;⑤细胞三维生长, 细胞密度是实心微载体的10 倍以上, 有的可达108 个/ mL; ⑥适用于长期维持培养,细胞生长情况依然良好; ⑦微载体浓度高, 实心载体在培养液中浓度增大到一定时, 细胞密度反而下降; 而大孔微载体在浓度较高时, 表面碰撞增加, 能促使细胞在孔内生长; ⑧最适合于蛋白质生产和产物分泌。因此有人预言, 大孔微载体质生产和产物分泌。因此有人预言, 大孔微载体技术将成为动物细胞大规模培养的一种常用方式。;1. 2 　包埋 将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。此法步骤简便, 条件温和, 负荷量大, 细胞泄露少。因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护, 细胞能抗机械剪切。但该法也有一定缺点, 如扩散限制, 并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。多孔凝胶是最常用的载体, 用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。;1. 2. 1 　海藻酸钙凝胶 海藻酸钙凝胶包埋法是将动物细胞与一定量的海藻酸钠溶液混合均匀, 然后滴到一定浓度的氯化钙溶液中形成直径约1 mm 内含动物细胞的海藻酸钙胶珠, 分离洗涤后即可用于培养。此法操作时条件温和, 对活细胞损伤小。但固定后机械强度不高。为了大量制备海藻酸钙凝胶包埋的固定化细胞, 国外已有专门的振动喷嘴设备可供使用。;1. 2. 2 　琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶可用二相法制得。将含有细胞的琼脂糖溶液