医学免疫 酶免疫技术.pptVIP

酶免疫技术 基本概念 抗原抗体反应具有高度特异性 酶对底物反应具有高效催化性 酶免疫技术是将两者有机的结合起来 通过化学方法将酶与抗原（抗体）连接，形成酶标物 抗原抗体反应后，观察酶所对应的底物显色情况 检测方法具有高度特异、高度灵敏的优点 按应用的实际目的分为 酶免疫组织化学技术（EIHCT） 用于组织切片或其他标本中的抗原定性、定位的检测 酶免疫测定（EIA） 酶免疫测定 用于检测标本中抗原（抗体）定性或定量的检测 　 ELISA 基本原理 将抗原（抗体）连接在固相载体上，保留免疫学活性 将抗原（抗体）与酶连接，形成酶标物，保留各自的活性 按一定的步骤在固相载体上，分别加入待测标本和酶标物 充分反应后，通过洗涤去除游离物质 在固相载体上加入底物，测定底物的显色情况（肉眼、酶标仪）对待测物质作出定性或定量的判定 技术要点 包被 酶结合物及底物 洗涤液 酶标仪 包被 将抗原（抗体）连接在固相载体上的过程称为包被　 固相载体的选择 对蛋白质有较强的吸附力 本身不参加免疫反应或化学反应 空白值低、孔底透明 价格低廉、来源广泛 聚苯乙烯制成的微量反应板为最常用的固相载体 过程 确定免疫吸附剂（抗原、抗体）最适工作浓度 将抗原/抗体用50mmol/L CB溶解至最适工作浓度加至固相载体上，4℃过夜或37℃2～6小时，洗涤 用无关的蛋白质对反应板上未被占据的空隙进行封闭，洗涤，低温下保存 酶结合物 酶的选择 活性高、性质稳定 作用专一、受检标本对酶活性影响小 易与抗原（抗体）结合，保留各自活性 检测酶活性方法简单、灵敏，底物易配制、保存 酶、辅助因子及底物对人体无害 酶及底物价廉、来源广泛 辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）常用 酶结合物 HRP 分子量小（40KD），易透入细胞 标记方法简单 性质稳定（pH、温度、有机溶剂） 易溶 价格便宜、易得 底物种类多 内源性的过氧化物酶有干扰、某些化学物质抑制其活性 标记方法 改良过碘酸钠标记法 底物 HRP催化的反应 　H2O2＋DH2（无色）＝2H2O＋D（有色） ELISA中常用的底物 洗涤液 由表面活性物质吐温20（Tween20）与缓冲液组成 作用 增强抗原抗体的结合 去除未结合的游离物质 减少非特异性吸附 注意事项 加洗涤液后静置数秒 勿溢出至其它孔，导致孔间污染 每次需将洗涤液拍干 洗涤次数为4～5次 酶标仪 ELISA试验结果根据底物的显色情况加以判定 按要求需用酶标仪进行检测 酶标仪是通过检测反应孔中液体吸光度来判断颜色的深浅 注意事项 比色前需加终止液 常用2mol/L硫酸或盐酸 目的　终止酶促反应、促使吸收峰转变 阴性对照测定值对结果的判断至关重要 已知不含待测物的标本为阴性对照品 除竞争法外，结果判定为 A待测/A阴性≥2.1　待测标本判为阳性 A待测/A阴性＜2.1　待测标本判为阴性 ELISA的技术类型 检测抗原 双抗体夹心法 双位点一步法 竞争法 双夹心法 桥联法 检测抗体 间接法 双抗原夹心法 竞争法 桥联法 捕获法 双抗体夹心法 双位点一步法 原理 为双抗体夹心法的改良 待测抗原必须具有两个以上的决定簇 固相抗体、酶标抗体为分别针对待测抗原两个不同决定簇的单克隆抗体，称为双位点 将待测抗原与酶标抗体同时加入反应孔中，为一步法 注意可能出现钩状效应 钩状效应 在ELISA双位点一步法中待测抗原浓度过高导致结果的假低值甚至假阴性，它不同于带现象 竞争法 原理 双夹心法 原理 桥联法 原理 间接法 原理 双抗原夹心法 原理 竞争法 原理 捕获法 原理 Ag -E + Ab E -Ag-Ab 游离的抗原、抗原抗体复合物上都有酶分子 反应结束后，免疫反应的进行与否及程度，通过反应体系中的酶活性来体现 均相酶免疫测定 　　特殊设计的酶标物，使反应结束后，不需分离游离和结合状态的酶标物，即可对反应作出判定 非均相酶免疫测定 需分离游离和结合状态的酶标物，通过检测结合状态的酶活性，对反应作出判定 固相Ag 固相Ab HRP-CH2-OH NaIO4 HRP-CHO +H2N-IgG HRP-CH2-NH-IgG -戊二醛交联标记法 OPD TMB 保存 避光稳定 不稳定，现配 产物 黄色、可溶 蓝色、可溶，加终止液后变黄色 比色波长 492nm 450nm 免疫组化中常用的底物为DAB，被酶作用后生成棕色不溶物质 原理 固相抗体 酶标抗体 底物 显色 无关抗原 洗涤液 如待测标本中有相应抗原最后形成固相抗体、待测抗原和酶标抗体复合物，加底物显色，结果判定为阳性。显色深浅正比于待测抗原的浓度 用于大分子抗原的检测。例：HBsAg、HBeAg 固相抗体 酶标抗体 洗涤液 酶标抗体 　　 底物 必要时，可将标本进行稀释，以消除钩状效应 无抗原 固相抗体 固相抗