质粒提取及双酶切鉴定..pptVIP

质粒提取及双酶切鉴定 2011年5月9日 主要内容 一、实验目的及原理 学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法 学习和掌握双酶切鉴定 二、实验原理 （一）质粒提取原理 质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 本实验采用SDS（十二烷基硫酸钠）碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。 （二）双酶切原理 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现。 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类，我们这里用到的是Ⅱ型。 Ⅱ型限制性内切酶它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’