RNA的提取及定量PCR检测技术.ppt-生物化学与分子生物学.pptVIP

图3-9 TaqMan荧光探针 实验专题模块五 RNA的提取及定量PCR检测技术 总RNA的提取 反转录 实时荧光定量PCR RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。 获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如cDNA合成、定量PCR、Northern杂交及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。 RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mRNA仅占1%～5%。从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响后续RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度相对较大。在实验中，一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶；另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染。 注意与要求： ① RNA操作应在专门的区域进行，离心机、移液枪、试剂等均应专用。 ② 操作过程中应自始至终佩戴一次性橡胶或乳胶手套，以避免将手、臂上