用酶解酵母细胞壁.PPT

第八章 酵母菌的基因工程 酵母菌的特征 用于转化子筛选的标记基因 酵母菌的载体系统 酵母菌的表达系统 8.1 酵母菌的特征 酵母菌是一群以牙殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核微生物。 酵母菌表达外源基因的优势 酵母菌基因组已测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简单。 蛋白翻译后可修饰加工 安全性高 大规模发酵工艺简单，成本低 能将表达产物分泌到培养基中 特别适合于遗传分析 酵母菌的选择 选择转化率高的菌株 选择回复突变频率低的菌株 8.2 用于转化子筛选的标记 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如lue2，trp1， his3和 ura3 。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的。 组氨酸his3—咪唑磷酸甘油脱氢酶; 亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶; 赖氨酸lys2—β-氨基已二酸还原酶; 色氨酸trp1—N-邻氨基苯甲酸异构酶; 尿嘧啶ura3—乳清苷-5`-磷酸脱羧酶; 亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆的筛选（书１７０页图）． 8.3 酵母菌的载体系统 8.3.1 野生型酵母质粒: 2μm环状质粒，存在于酿酒酵母中，是6318bp大小的野生型2μm长双链环状质粒，其拷贝数达50-100。其上有复制起点、4个基因、使质粒在细胞中稳定的STB序列。 ８.４酵母菌的表达系统 酵母启动子 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 １.　ｍＲＮＡ稳定性降低 ２.　ｍＲＮＡ的表达水平降低 ３.　密码子的偏爱性 * * 酵母菌的转化 (1)利用酵母的原生质球进行转化 ： 首先，用酶解酵母细胞壁，产生原生质球，再将原生质球置于DNA、CaCl2和多聚醇(如聚乙二醇)中，多聚醇可使细胞壁具有穿透性，并允许DNA进人。然后使原生质球悬浮于琼脂中，并使其再生新的细胞壁。 (2)利用Li+盐进行转化： 这种方法不需要消化酵母的细胞壁，产生原生质球，而是将整个细胞暴露在Li+盐(如0.1 mol／L LiCl)中一段时间，再与DNA混合，经过一定处理后，加40％PEG4000，然后经热应激等步骤，即可获得转化体。 1.克隆载体的种类 1) 按复制方式划分 i.???自主复制型； ii. 整合型（非自主复制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按复制子来源划分 ???????????? i. 附加体型- yeast episomal plasmid(YEp)，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒-2μ质粒 ??????????? ii. 染色体复制型- Yeast Replicating plasmid(YRp)，其复制起点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomous replicating sequence) 8.3.2 酵母菌载体及构建 酿酒酵母载体的种类和构建 (1). YIp载体－酵母整合型载体 该类载体依靠本身携带的某种酵母基因与酵母染色体上的同 源DNA发生同源重组而整合到染色体上去。这种转化体十分稳定，但转化率低（１－１０个转化子／微克ＤＮＡ）．由ＣｏｌＥ１质粒和酵母提供的基因（亮氨酸lue2）构成． 载体的整合 (2). YRp载体－酵母复制型载体 1）酵母染色体复制子（ARS） 酵母染色体总长为15,000 kb,根据电镜观察结果预计有400个复制起点，根据基因克隆分离ARS的实验结果估计有480个ARS。 2） YRp７由ｐＢＲ３２２质粒和酵母提供的基因（色氨酸ｔｒｐ１）、复制子（ARS）构成． YRp的特点 i. 高频转化（１千－１万个转化子／微克ＤＮＡ）． ii.??转化子不稳定 iii.?子代细胞质粒分散不均匀 iv.?可整合到染色体中去，与YIp整合过程相同 YRp载体示意图 (3). YEp载体---酵母附加体型载体 1) 酵母2μ质粒 2μ质粒的结构 2）YEp载体 YIp中可插入整个或部分2μ质粒DNA构成YEp。大多数酿酒酵母菌株中都含有2μ质粒，YEp复制所需的酶可由2μ质粒提供。 YEp具有Y