微生物检验学之细菌的生物化学试验.docVIP

细菌的生物化学试验 　　● 考点　　碳水化合物的代谢试验　　蛋白质和氨基酸的代谢试验　　碳源和氮源利用试验　　各种酶类试验　　抑菌试验　　复合生化试验　　不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定，主要通过这些生物化学试验。 　　　　一、碳水化合物的代谢试验　　原理：细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。　　1.糖（醇、苷）类发酵试验　　原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。　　培养基：在培养基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。 　　方法：接种，培养。结果：产酸：培养基中的指示剂呈酸性反应。　　产气：可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。　　不分解：培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。　　应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。　　2.氧化-发酵试验（O/F试验）　　（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖而分解蛋白胨的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。　　（2）培养基HL：Hugh-Leifson培养基。　　（3）方法：将待检菌同时穿刺接种于两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液状石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。将培养基于35℃培养48小时或更长。　　（4）结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加液状石蜡的培养基产酸为氧化型。　　（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与不发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。　　3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）　　（1）原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚。　　（2）试剂：0.75M ONPG溶液　　（3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5分钟，加入0.25mlONPG试剂，水浴20分钟～3小时观察结果。　　（4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30分钟内显色。　　（5）应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。　　4.七叶苷水解试验　　（1）原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。　　（2）培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。　　（3）方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。　　（4）结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。　　（5）应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。　　5.甲基红试验　　（1）原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。　　（2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。　　（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2～4天，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。　　（4）结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。　　（5）应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。　　6.V-P试验　　（1）原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙