用氨甲蝶呤偶联琼脂糖亲和吸附法从人肝脏cDNA噬菌体展示文库中.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（１０）：７０～７４ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 技术与方法殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 用氨甲蝶呤偶联琼脂糖亲和吸附法从人肝脏ｃＤＮＡ 噬菌体展示文库中筛选氨甲蝶呤相互作用蛋白 １，２ １ １ １ 于晓明 　张维冰 　张丽华 　张玉奎 （１中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心　大连　１１６０２３　２　中国科学院研究生院　北京　１０００４９） 摘要　目的：利用氨甲蝶呤（ＭＴＸ）偶联琼脂糖凝胶吸附法从人肝脏细胞ｃＤＮＡ噬菌体展示文库 中筛选与ＭＴＸ相互作用的蛋白。方法：以偶联于琼脂糖凝胶表面的ＭＴＸ为配基，通过“结合－洗 脱－扩增”过程筛选与ＭＴＸ相互作用的噬菌体。利用ＰＣＲ对筛选结果进行监测，对筛选得到的 噬菌体ＰＣＲ产物进行序列测定和基因同源性分析。结果：通过五轮亲和筛选富集到特异噬菌体 克隆，再通过ＰＣＲ获得ｃＤＮＡ插入片段。通过ＢＬＡＳＴ程序搜索ＧｅｎＢａｎｋ，证明筛选到的片段与人 ＰＩ３Ｋ相关蛋白激酶ＳＭＧ１异构体１蛋白同源性达１００％。结论：利用偶联ＭＴＸ的琼脂糖凝胶作 为筛选基质，从Ｔ７噬菌体展示ｃＤＮＡ文库中富集特异噬菌体是一种方便、高效的ＭＴＸ相互作用 靶蛋白筛选方法，可为探讨小分子药物的分子作用机制提供借鉴和参考。 关键词　噬菌体展示技术　肝脏细胞　ｃＤＮＡ文库　氨甲蝶呤　相互作用 中图分类号　Ｑ８１９ 　　噬菌体展示技术是一种用于研究蛋白质与蛋白 　　由Ｎｏｖａｇｅｎ公司构建的Ｔ７噬菌体载体能将外源基 质、药物小分子与蛋白质相互作用的新技术。它将基 因序列插入到编码Ｔ７噬菌体包膜蛋白基因中，所表达 因型与表型联系在一起，利用分子之间的相互作用，通 的多肽或蛋白以与噬菌体包膜蛋白融合的形式展示在 过亲和筛选得到表达目的蛋白的噬菌体重组子，获取 噬菌体表面。通过三至五轮亲和筛选，能够从ｃＤＮＡ展 编码核苷酸序列［１，２］。噬菌体展示技术可以用于构建 示文库中特异性地富集和分离含有目标基因或蛋白表 随机多肽库［３～５］、噬菌体抗体库［６～８］和 ｃＤＮＡ文 ［１３］ 达的噬菌体 。目前关于从噬菌体展示 ｃＤＮＡ文库 库［９～１１］。噬菌体展示文库的亲和筛选过程通常是先 中筛选与药物小分子相互作用蛋白的相关报道中，小 将筛选配基固载于载体表面，再通过几轮“结合－洗脱 分子作为筛选配基通常先被生物素衍生化后，固载于 －扩增”的筛选过程对目标噬菌体进行富集。 包被亲和素或链霉亲和素的微孔板或磁珠表面，再用 　　氨甲蝶呤（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，ＭＴＸ）是一种抗叶酸代谢 于文库筛选［１４，１５］。上述衍生化和固载过程比较复杂， 药和免疫抑制剂，已被广泛用于白血病、淋巴瘤、实体 而且价格昂贵。本文选用偶联 ＭＴＸ的琼脂糖凝胶为 ［１２］ 瘤、器官移植和类风湿关节炎等疾病的治疗 。ＭＴＸ 筛选介质，从噬菌体展示人肝脏细胞ｃＤＮＡ文库中筛选 的化学结构与叶酸类似，可以抑制二氢叶酸还原酶，使 出与ＭＴＸ相互作用的蛋白，为进一步研究氨甲蝶呤的 二氢叶酸不能变成四氢叶酸，从而使脱氧胸苷酸合成 作用机制和毒性提供了实验依据。 受阻。进而影响ＤＮＡ合成，抑制肿瘤细胞生长。 １　材料与方法 收稿日期：２００７０６２５　修回日期：２００７０８２４ １．１　文库和菌株 中国科学院知识创新工程重要方向资助项目（ＫＪＣＸ２．ＹＷ．Ｈ０９） 通讯作者，电子信箱：ｌｉｈｕａｚｈａｎｇ＠ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ