引物设计原则(最全汇总情况).docVIP

实用标准 文档 引物设计原则（汇总） 普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）：? 1.?普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性；? 2.?下载基因序列到Vector?NTI；?3.?找到所需安装载体序列；?4.?将基因序列的CDS高亮标记；? 5.?寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。酶切位点一般是6bp的回文序列；? 6.?从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；? 7.?将上游酶切位点序列补在ATG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。注意，所有的补齐不能用到终止密码子；? 8.?检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码；? 9.?从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；? 10.?选择complementary?sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果t