免疫实验ICC用细胞抗原的制备.docxVIP

ICC用细胞抗原的制备 _、材料和试剂 1.0.01M PBS(pH7.4) : NaCI 8.0g ; KCI 0.2g ; Na2HPO4 1.44g ; KH2PO4 0.24g ; ddH20 至1000ml ;高压灭菌,分装。 2、0.25% 2、0.25%胰 :称取 EDTA 0.02g NaCI 0.8g KCI 0.04g 加三蒸水 100ml 溶解后加 0.25g 胰 酶，轻轻搅动，使胰酶溶解，不要产生泡沬，加酚红少许，调PH值到8.2-8.6M滤除菌，分装10ml/ 管厂20°C保存临用前预温到37°CO 3、 诱导液仃PA) : 12?邻?十四酰?佛波醇-13-乙酸酯 (12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)溶于丙酮,配成 20mg/mlo 二实验步骤 （一）、用96孔级胞培养板制备贴壁细胞抗原（正常贴壁细胞） 1、 HFF,NIH3T3细胞用含10%血清DMEM完全培养液在75cm2培养瓶中单层培养，使密度达 到90% 2、 倾去培养液,用无菌PBS液5-10ml洗细胞一次，用无菌吸管吸干PBS液。 3、 加0.25%胰酶（从?20°C取出在37工预温）75平方厘米培养瓶加lml,37°C温箱或有经验者可 在酒精灯周围，控制温度约37弋左右，轻轻摇匀使胰酶充分覆盖细胞表面。 4、 观察到细胞有松动，成流沙状下落;或在显微镜下观察，细胞已有收缩变圆时,用无菌PBS液 15?20ml,终止反应。 5、 轻轻吹打下细胞，使细胞单个分散，并充分混匀1500转/分离心5-10分钟，去掉上清液 6、打散细胞，加10ml含血清DMEM完全培养液混匀，取10ul在显微镜下计数，计算细胞浓度。 7、用含10%血清培养液调整细胞浓度至1x104个/lOOul,每孔（96孔）接种200ul（即2x104个 细胞/孔）,37°C CO2培养箱培养。 次日显微镜下观察細胞是否完全贴壁（一般24小时可完全贴壁准9去培养0.01M PBS液先二 次（孔中加满PBS,轻轻倒掉）并在滤纸上扣干仮复3次）应注意加液的力度，不能太大，以免冲掉细 胞，倒去上清液在滤纸上扣干水份，但保持细胞湿润。 9、 加90%冷丙酮固定，每孔200ul,5?10min摔去冷丙酮，用PBS洗三次扣干。 10、 在培养板上作好标记（细胞名称,制备时间）。 11、 保鲜膜封好,?70°C保存。 （二） 、悬浮细胞玻片法的抗原制备 1、 25平方厘米玻璃瓶用含10%血清的1640完全培养液培养BCBL-1细胞，密度达到80-90% 2、 加样枪充分吹匀细胞，收集于离心管中。 3、 1500转/分离心5?10分钟,弃去上清液。 4、 打匀细胞，用PBS洗二次，弃去上清。 5、 打匀细胞,加少量PBS液（根据肉眼观察细胞溶液的浊度估计）混匀，取少量在显微镜下计数，调 整浓度，估算在玻片上每个细胞涂片圈位（12圈）接种细胞1x104个。 6、 室温下干燥,然后加100%的冷丙酮室温固定3-5分钝PBST洗二遍。 7、 室温干燥作好标记然后放入玻片盒，玻片盒用塑料袋密封并放一袋防潮剂厂20°C保存，一个月 内有效。 （三） 病毒感染细胞抗原的制备 1、96孔培养的贴壁细胞的病毒感染及病毒抗原的制备 1）未感染细胞接种到96孔板（方法见悬浮细胞玻片法抗原制备步）,并完全贴壁。 2）摔去PBS液，加入少量病毒液（加入量由先做棋盘试验来确定浓度，或先测定病毒滴度而定，且 病毒液用2%-5%血清DMEM完全培养液稀释），每孔50ul,摇匀,使充分覆盖细胞表面Z37°C C02培养箱培养（MCMV感染NIH3T3 HCMV感染HFF 1 3） 每天观察细胞形态变化，早期CPE为细胞肿胀，中期聚集,晚期则圆缩。 4） 当圆缩细胞达到10%-30%左右細胞层出现明显的病灶同时还有正常细胞未感染即可收获 （一般情况下齐4天）。 5） 倒去上清（倒入有消毒液容器以防止污染环境）,用无菌PBS液洗2次（加满培养孔，倒掉，在滤纸 上扣干）。 6） 倒去上清加90%冷丙酮室温固定5?10min,每孔200ul。 7） 摔去冷丙酮，用PBS洗三次，扣干。 在培养板上作好标记（病毒抗原名称，制备时间等）。 9）保鲜膜封好,?70°C保存。 2、BCBL-1细胞的诱导和KSHV病毒抗原的制备 1 BCBL-1细胞扩大培养,细胞密度达到50% 2 TPA （120酰佛波醇乙酸酯），每毫升培养液加40ug （ TPA预先配成20mg/ml \ 3诱导三天后，收集少量细胞进行ICC预实验。 4 KSHV阳性细胞达到10%-30%时，可做细胞涂片，阳性细胞30%时可用于制备病毒细 胞裂解液。 5 KSHV阳性细胞达到10%?30%时,即可收获细胞加样枪充分吹匀细胞