PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链式反应.PDFVIP

PCR （Polymerase Chain Reaction ） 聚合酶链式反应 SBP中国办事处 Q:什么是PCR? A:PCR是利用热稳定DNA聚合酶在体外快速扩增（复制）某一特定DNA 片段的方法。 PCR发展简史 1953年 ，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。 1958年 ，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。 1970年代以来 ，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系 ，一是基因克隆技术 ，二是体外 扩增技术。 1971年 ，Khorana （美国MIT教授 ，1968年诺贝尔医学奖得主 ）等提出在体外经DNA变形 ，与适当 引物杂交 ，再用DNA聚合酶延伸 ，克隆DNA的设想。 1976年 ，台籍科学家钱嘉韵 （Alice Chien ）从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出 热稳定的Taq DNA聚合酶。 1985年 ，美国Cetus公司人类遗传研究室的 Mullis发明聚合酶链反应 （Polymerase Chain Reaction ，PCR ），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人 -珠蛋白的DNA ，并应用于镰刀状红 细胞贫血的产前诊断。 1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR ，整个反应只加一次酶即可 ，扩增特异性和 效率都明显改善 ，操作大为简化。 1989年被誉为 “分子年” ，列PCR为十余项发明之首。 1993年 ，Mullis荣获诺贝尔化学奖。 PCR原理 变性：DNA在加热到95ºC后 双链会发生解链变性。 退火：变性DNA快速冷却到 65ºC以下使特异性引物互补 结合到单链DNA上。 延伸：混合物加热到72ºC激 活DNA聚合酶活性， 催化子 链DNA的合成。 • DNA是由大量碱基组成的长链状分子。 • DNA基于A-T/G-C特异性的结合形成碱基对（bp)。 • 碱基对连接到螺旋状的糖链骨架上。 • DNA加热到95ºC 以上时碱基对分离形成两条单链。 • 冷却后碱基将按照A-T/G-C的配对模式重新结合。 • 如果有其它小片段DNA （引物）加入到反应体系中，它们将按 照碱基配对的模式结合到分离的单链DNA上。 DNA延伸 PCR的扩增效率 循环数 扩增子数(靶序列拷贝数) 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824(10亿) n • 理论扩增率：2 递增 （n为循环次数 ），25 ～30循环 ，目标 9 DNA可增加10 倍。 • 实际扩增率：( １＋Ｘ)n ，X为PCR的实际扩增率 ，平均约为 75%。 • 由于引物和底物的消耗 ，酶活力的下降等因素 ，扩增产物的增 加 ，逐渐由指数形式变为线性形式 ，所以实际上进行30个循环 6 7 后 ，扩增倍数一般可达10 ～10 。 • 以上 “变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。 PCR扩增曲线