microRNA研究策略-汉恒生物.PDFVIP

microRNA 研究概述 microRNA 研究策略 MicroRNA （miRNA ）是一类内生的、长度约 20-24 个核苷酸的小 RNA ，几个 miRNAs 也可以调节同一个 基因。可以通过几个 miRNAs 的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA 调节着人类三分之一的基 因。MicroRNA 存在多种形式，最原始的是 pri-miRNA ，长度大约为 300~1000 个碱基；pri-miRNA 经过一次 加工后，成为 pre-miRNA 即microRNA 前体，长度大约为 70~90 个碱基；pre-miRNA 再经过 Dicer 酶酶切后， 成为长约 20~24nt 的成熟miRNA 。 microRNA （以下简称mir ）研究策略： 功能模型芯片筛选-QPCR 验证-mir 基因靶向操作-功能验证-寻找靶标与靶标蛋白内源性验证-靶标蛋白外 源性 luciferase-3’UTR 验证-靶标回复实验 （rescue 实验） 1. 功能模型芯片筛选：选用有功能差异对比的样本，进行 mir 芯片筛选 （mir-array ），筛选出变化 明显的mir 。 现在主流的芯片平台是 Agilent 和 Affymetrix ，Agilent 只检出成熟体，而 Affy 的芯片前体和成熟体皆检出， 假阳性率较高，但 Affy 的容量相比Agilent 的大很多。 汉恒生物 （Hanbio ）提供 Agilent 和 Affymetrix 平台的 mirarray 筛选服务及后续的芯片数据分析及靶基因 聚类分析。 2. 芯片结果的 QPCR 验证：用与 1 中相同的样本，对 1 中筛选出的mir 进行 QPCR 验证，挑选出 丰度高且变化显著的mir （以下简称mir-X ）。 Mir 的QPCR 验证最首选的当然是 Life 的Taqman 系列探针和 kit ，权威，但价格极其昂贵。与之相比， 特定引物 SYBR 法检测 mir 价格适中，但误差率较高。 汉恒生物 （Hanbio ）特有一步反转技术，特异性好，简单易用。汉恒已开发出针对不同种属 mir 的miRNA 快速检测技术 MiRQeasy，与市面一般的 mir 引物相比，信号更单一，且操作极其简便。汉恒独有 MiRTeasy 一步法反转录试剂，一次性转录，兼顾了专一性和通用性。 3. MicroRNA 基因操作： - 91 - 汉恒生物科技 (上海)有限公司 400-092-0065 地址：上海市徐汇区斜土路 1175 号景泰大厦 1503 021 实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器 1 号楼 314 汉恒生物科技 邮箱：service@ microRNA 研究概述 原则： 与 mir 变化相反的处理是否取缔功能表型的变化，而同向 mir 变化处理是否能模拟出功能表型变化。比如 我们发现 mir-X 在细胞某种诱导分化后升高，则诱导时取缔这种升高是否会抑制分化，而单单升高该 mir 能否 模拟出细胞分化表型。 1） 初筛选： 选取出若干芯片与 QPCR 验证变化一致，且组织表达丰度较高的 Mir ，运用 Mimics （过表达）和 inhibitor （封闭）分别在细胞中过表达和封闭特定的 mir ，观察细胞功能的变化。 注：Mimics 和 inhibitor 表达时程很短，一般 72-96 小时，所以一般只作为初筛。 2 ）mir 与 Anti-mir 的克隆高表达： Mir 过表达：从 miRbase 上调出 pri-mir 序列，直接克隆 pri-mir 至表达载体。 Mir 下调：构建 mir 的下调即封闭，主要的技术是 sponges 技术。将若干段连续 mir 成熟序列互补序列串 联，使之在细胞内表达，吸附目标 microRNA ，所以称之为