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外泌体最新研究进展 成像流式的新发现 外泌体是一种直径为30-100nm 的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA 和microRNA 等物 质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在 血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。越来越多的证据表明，宿主细胞 或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。免疫细胞和肿瘤细胞之间通过外泌体进行信 息交换，这种通讯方式在调节肿瘤免疫中发挥了双重作用。外泌体既可以通过抑制免疫细胞（DCs、NK 细 胞、CD4+ 和CD8+ T 细胞等）引发的抗肿瘤反应，以及诱导免疫抑制或调节细胞群（MDSCs 、Tregs 和Bregs ） 的免疫抑制。 外泌体产生过程的示意图： Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles Emanuele Cocucci and Jacopo Meldolesi, Trends in Cell Biology, June 2015. Vol. 25. No.6 过去研究外泌体的主要工具包括Nanosight 、Apogee 、confocal 和传统流式细胞仪。这几种工具各有优 点，也都具有其局限性，如Nanosight 、Apogee 和传统流式细胞仪只能检测外泌体颗粒，测量外泌体的浓度， 对外泌体进行定量。无法研究细胞与外泌体的相互作用以及外泌体功能；confocal 可以拍摄到细胞分泌和吞 噬外泌体，但是因为缺乏合适的量化参数，无法对吞噬过程进行量化分析，也无法定量产生的外泌体。而且 confocal 的通量太低，结果也可能存在人为偏倚性而不够客观。Amnis 量化成像流式细胞分析技术，很好地 解决了上述研究手段存在的问题，是目前为止研究外泌体产生机理及外泌体功能的最佳方法。Amnis 能够同 时采集12 个检测通道中的细胞和颗粒物图像，其中包括明场、暗场，以及10 个荧光通道。Amnis 每个检测 通道都有100 余种量化参数，如面积、直径、长度、厚度、细胞短轴与长轴比值、荧光强度等等，这些参数 可以提供传统流式和显微成像设备都不具备的量化统计学功能，获得全新的细胞或颗粒物量化统计学数据。 Amnis 采用最先进的用于航空遥拍的TDI CCD （Time Delay Integrated CCD ）收集荧光信号，可以采集到液 流中快速移动的细胞和小颗粒物的清晰图像，对数万乃至数以十万的细胞或小颗粒物的荧光信号进行量化 分析。Amnis 既具有显微成像的功能，可以呈现细胞和小颗粒物的细节，又具有对海量数据进行快速分析的 统计学功能。因此，Amnis 量化成像流式细胞分析技术可以为外泌体的研究提供强有力的技术支持。 一， 定量检测样本中的外泌体 过去十年间，外泌体研究成为新的研究热点，人们意识到微小的外泌体在生物体中扮演了非常重要的 角色，例如外泌体参与了从凝血到细胞间信息交流等各种生理过程，而且外泌体与动脉硬化、风湿和肿瘤 等疾病相关。因此外泌体有望成为疾病风险预估或者临床诊断的工具。由于外泌体的直径只有几十纳米， 而且产生外泌体的样本复杂多样，因此迫切需要开发一种可以精确定量检测样本中外泌体的技术。量化成 像流式细胞技术因其灵敏度高、通量高、检测样本量低，并且适合检测全血、血浆、白细胞上清液等复杂 的样本，成为定量检测细胞分泌产生外泌体的最佳研究工具。“Cutting-Edge Analysis of Extracellular Microparticles using ImageStreamX Imaging Flow Cytometry”文章中报道了利用Amnis检测到了直径20nm微珠 的荧光信号，并拍摄到了直径为100nm的微珠的图像。这个结果也证明了Amnis 的灵敏度和图像分辨率足 够检测直径范围在30-100nm的外泌体。 此外，文章中还定量检测了嗜中性粒细胞受到TNF-α 刺激后产生的微囊泡，以及随着TNF-α 刺激时间 延长，微囊泡生成的动力学曲线。这些微囊泡中就包含了外泌体。利用荧光抗体标记母体细胞，可以通过微 囊泡携带的荧光标记，定量分析微囊泡的来源。文章中检测了6 个健康供体血浆中的微囊泡，并对这些不同 来源的微囊泡进行了定量分析。 二， 研究外泌体与肿瘤细胞和免疫细胞之间的互作 外泌体因其来源不同而功能各异，有些可以刺激免疫反应，有些可以抑