质粒的限制性内切酶反应.pptVIP

实验　质粒的限制性内切酶反应分析 实验目的 1、掌握限制性内切酶的工作原理，掌握酶切体系建立原则 2、熟悉基因工程所用的限制酶的特点 实验原理 　限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。 　由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶) 。 限制性内切酶可分为三类 Ⅱ类限制性内切酶 分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘性末端的DNA。如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端： 5…GAATTC…3‘ → 5… G AATTC…3 3…CTTAA G …5 → 3… CTTAA G…5 Hind III: A AGCTT TTCGA A EcoR V: GAT AGC CTA TAG Sma I (30 ℃) CCC GGG GGG CCC 实验仪器与试剂 仪器： 　恒温水浴锅、离心管、移液器、枪头、离心机、电泳设备等。 试剂： 　 pUC19质粒，EcoR I酶，酶切缓冲液，琼脂糖，电泳缓冲液，EB，10x上样缓冲液，无菌水等。 实验步骤 1、在一个洁净的0.5 ml离心管中混匀下列反应物 实验步骤 2、6000 rpm/min稍离15 s，将反应物置于37℃水浴中温浴1～2 hr。 3、配胶：称取1.4 g琼脂糖粉末，加入160 ml 1xTAE （配2瓶） ，反复煮沸三次后，待冷却至约60 ℃后，倒胶，等待凝固（约30 min），得到1%凝胶。 4、酶切完成后，稍离，加入2 μl 10x上样缓冲液混匀，然后上样。另上样20 μl Marker，以及1份10 μl 质粒（混合2 μl 10x上样缓冲液）作为对照，120V电泳1hr。 5、在紫外分析仪（凝胶成像系统）上观察酶切的结果。 星号活性：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。-----非特异性 酶量过大：≧25U/ μg DNA(较高的甘油浓度 ) 低盐浓度（25 mM） 高pH值（pH 8.0） 存在有机溶剂 Company LOGO * 实验结果与讨论 实验步骤 实验仪器与试剂 实验原理 实验目的 限制性内切酶 酶分子 识别位点 切割位点 限制作用是否需用 ATP Ⅰ类 三亚基双功能酶 二分非对称 至少在识别位点外 1000 bp Yes Ⅱ类 (93%) 内切酶与甲基化酶分子不在一起 4-6 bp, 大多数为回文对称结构 在识别位点中或靠近识别位点无特异性 No Ⅲ类 二亚基双功能酶 5-7 bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp Yes 限制酶的命名是根据细菌种类而定，一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。 1.5 10×Buffer 5 dd H2O 0.5 EcoR I (10U) 8 质粒DNA (1μg) 体积（μl） 反应物 最终至15 μl 6000 rpm/min稍离15 s，将反应物置于37℃水浴中温浴1～2 hr。 电泳检测示例 注意事项 1、内切酶要保持在冰浴上，避免长时间置于高温中。 2、加样时枪头直接垂直伸入EP管底部，避免碰到管壁，每加完一个样要更换枪头。同时要记住加样的顺序，以免漏加或错加。 3、加样时酶最后加，并且加完酶后要用枪头充分混匀。 4、注意酶的用量、消化反应温度和时间。限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶, 消化1～2 hr。过少酶切不完全，过多会产生“星号活性”。 思考题 如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能是什么原因？