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原代肿瘤细胞的分离培养 实验目的：从新鲜人体标本中分离肿瘤细胞 实验器材：新鲜人体乳腺癌组织 　　　　　胶原酶（Ⅰ、Ⅳ型胶原酶干粉溶解于DF12培养基，浓度1mg/ml），DMEM培养基，胎牛血清，PBS，双抗（青链霉素，100×） 　　　　　手术器械，培养皿，培养瓶，离心管，恒温摇床，离心机，倒置显微镜，细胞培养箱 实验原理： 酶消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。? ?酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶。胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开，适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，如?乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。 本实验就使用Ⅰ、Ⅳ型胶原酶对乳腺癌组织进行消化，以获取原代乳腺癌细胞。 实验步骤： 将新鲜乳腺癌组织置于培养皿中，加入适量ＰＢＳ，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用ＰＢＳ清洗两遍。 将癌组织放入新的培养皿中，加入少量DMEM培养基，使用眼科剪将组织剪成约1mm3大小的碎块。 转入15ml离心管中，用PBS冲洗数遍，组织块自动下沉后，除去PBS。 将组织块转入培养瓶中，加入5ml胶原酶和双抗（稀释至2×），吹散组织碎块，置于３７℃恒温摇床上消化组织，调节速度150r/min，每隔30min 待组织块镜下透光性良好，呈絮状时，转入15ml离心管中，1300r/min离心5min，弃上清。 加入PBS洗涤数次，反复吹打后，1300r/min离心5min，弃上清。 加入DMEM完全培养基（含1×双抗），反复吹打，转入培养皿中，镜下可见单个细胞及细胞团，细胞培养箱培养。 注意事项： 全程严格无菌操作。 取材要注意新鲜和保鲜。 取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，尽可能减少对细胞的机械损伤，切碎组织时应避免组织干燥。 若组织在消化时间较长时仍未散开，可采用多次提取消化法以减少酶对已消化下来的细胞的损伤。 活细胞工作站分析技术 一、 本显微镜主要观察方法简介 明场：适合常规镜检、病理、染色样品的观察方法。此观察方法优点是视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单。缺点是：透明标本对比度低，标本没有立体感。 相差：利用被检物体的光程（折射率x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差。鉴定活体细胞最实用、最经济的方法。 荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。荧光显微镜利用荧光光源激发样品中的荧光物质，检测激发光的情况 以上各种观察方法配合活细胞孵育装置，即可完成对活细胞的各种观察要求。活细胞孵育装置通过软件或TFT触摸屏中Incubation模块进行精细的调节。 二、系统开关机 开机顺序 打开显微镜电源总开关 打开显微镜开关 拍荧光时打开荧光光源 打开电脑及软件 关机顺序 先关软件，然后是荧光光源、显微镜开关、电源开关！！ 三、明场观察成像操作流程 1. 开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”) 孵育装置及电脑 2. 打开卤素灯的光闸“TL” 使光线透过聚光镜穿透样品 3. 调节光强，光路100%转到眼睛 4. 聚光镜打到H 位 5. 反射镜转轮打到BF明场位置 6. 低倍（如10X倍）下观察样品，通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置，并通过粗细调焦旋钮聚焦，然后再调至高倍 7. 准备拍照了，首先光路切换至相机 8. 打开软件，点开Live 按钮 9. 先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——如果彩色模式拍照需要做自动或互动式白平衡（White balance，Interactive）——再次曝光后——Snap成像——保存Save 10. 拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑 四、相差观察成像操作流程 1. 开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”) 孵育装置及电脑 2. 打开卤素灯的光闸“TL” 使光线透过聚光镜穿透样品 3. 调节光强，光路100%转到眼睛 4. 聚光镜根据物镜后面的Ph标注打到Ph 1/ Ph 2 或Ph3位 5. 反射镜转轮打到BF位 6