课件：《正向间接血凝试验》PPT课件.ppt

* * * 正向间接血凝试验 省疫控中心 周迎春 主要内容 背景 原理 实验器材的优化 试剂的优化 样品的优化 实验过程优化 判定标准 注意问题 一、背景 正向间接血凝试验(IHA)是上世纪 60 年代在我国发展起来的血清学诊断技术，是一种用已知抗原检测未知抗体的试验方法，它的操作方法相对简单，实验原理也易于理解，在基层实验条件和技术相对落后的情况下经常被应用到，在一些动物疫病的免疫抗体检测、疫病诊断上具有现实意义。 林琳等研究表明应用猪瘟正向间接血凝法(IHA)与斑点酶联免疫吸附试验（dot- ELISA）以及猪瘟抗体免凝金标试纸条比较，对规模化养猪场 138份不同阶段猪血清进行检测，三种方法检测抗体的阳性率结果接近。 一、背景 数十年来正向间接血凝试验技术不断完善，它具有简单、经济、快速、实用的特点，在我国有很大的用户群，近年来，兰州兽医研究所生产的液体猪瘟和口蹄疫正向间接血凝试验的试剂用量在逐年加大。然而，正向间接血凝作为一种微量的定量反应试验，实验结果受操作技术影响较大，任何操作环节的纰漏都会使最后判定的结果与正确结论大相径庭。 为规范操作，本次培训就实验中器材、试剂、样品、过程和判定标准等方面的优化做一综述，以期作为此实验的借鉴。 二、原理 正向间接血凝试验的原理是将可溶性抗原吸附于与免疫无关的载体（红细胞）表面，此吸附抗原的红细胞与相应的抗体结合，在有电解质存在的适宜条件下发生的肉眼可见的凝集性反应。 二、原理 充分理解正向间接血凝试验的原理，对整个试验的操作和结果判定都具有很大的指导意义。 三、实验器材的优化 本实验所使用的实验器材包括微量血凝板，微量振荡器，移液器和吸头，为保证实验的顺利进行，要选择质量有保障，稳定性好的器材。 三、实验器材的优化 1、微量血凝板 实验室经常使用的是有机玻璃材质 或者一次性的110°底角的 96 孔 V 型微量血凝板。有机玻璃板板可以叠放，不占实验室台面，处理样品量较大时合适，但每次用完需要清洗。清洗方法：一般先用清水浸泡，然后马上用高压清水冲洗，洗净后用手甩干板子倒置于37℃温箱中烘干。用前要先检查血凝板孔底是否干净，如发现有透光性差一点的孔，可用酒精棉签擦净。除了有机玻璃板以外，还有一次性血凝板，不需清洗，也不用担心板子不干净影响结果，但不能叠放，测定少量样品适合。 三、实验器材的优化 2、 微量振荡器 使用振荡器振荡时间不宜超过 10 秒钟，振荡强度不能太大，先从小到大，中等强度即可。多块板叠加后振荡时要用手压住最上一板，以防上下的振动造成孔中液体溅出而影响实验结果的准确性。如果实验室没有它，也可用手轻拍血凝板的边缘即可。 三、实验器材的优化 3 、单、多道微量移液器 建议使用高质量的移液器，用定量移液器需要准备 50 微升和 25 微升两种。50 微升的用来加稀释液和稀释血清，25 微升的用来加血凝抗原。可调的移液器要选择与检测过程中加样量相近量程的移液器，吸取液体时动作要轻缓，防止溶液吸入过快，冲入移液器污染柱塞或造成堵塞漏气。一定要养成移液器用完后放在移液器架上的习惯，移液器如果掉到地下很容易损坏。用完后移液器用 75%的酒精棉擦拭，并把刻度调到最大值。 三、实验器材的优化 4、 吸嘴 高质量的吸嘴经过处理后可以重复使用。处理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超声波清洗器处理10分钟，换水后用二层纱布包好，用洗衣机甩干，再用超声波清洗器处理 10 分钟，再用洗衣机甩干，高压消毒灭菌器中 121℃，20分钟即可，去盖放 37℃温箱中烘干。吸嘴用完后没有用清水浸泡的很难洗干净，不必重复使用。接触过高感染性材料的吸嘴要高温消毒后废弃。经过处理后的吸嘴如果尖头变弯，则质量不好，不要重复使用。 四、试剂的优化 1、 抗原 液体正向血凝抗原摇匀后呈咖啡色，无块状物沉淀，静置后血球逐渐沉入瓶底。摇匀后能很快形成均匀混悬液的是好抗原，摇匀后仍有小块黑色沉淀物（血球团）的抗原建议不要使用。如果只做筛检看是否达到合格线，一瓶抗原可以检测 30 到 50 份血清。值得一提的是液体正向血凝抗原 4~8℃保存，保存期3个月，不能冷冻保存。 四、试剂的优化 2、对照血清 阴性对照血清呈淡黄色清亮液体，阳性对照血清微红或淡黄色略微混浊的液体。阴阳性对照血清可在- 15℃到 - 20℃保存，有效期 1 年。 3 、稀释液 稀释液无色透明，一般情况 4~8℃保存。用前建议将稀释液放 室温或37℃温箱中半小时后摇匀再用较好。试剂不能放置太久，最好新进现用。 五、样品血清的优化 新分离血清尽快检测完，未检血清 - 20℃保存。冷冻血清待检时需融化，同时避免血清反复冻融影响检测结果。严重溶血、严重污染、腐败或有悬浮杂质的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。 六、实验过程优化 正向血