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课件:实验七猪圆环病毒病PCR诊断.ppt
实验七 猪圆环病毒病PCR诊断 实验目的: 1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤; 2、掌握猪圆环病毒PCR检测的方法; 实验内容: 1、讲述PCR反应的原理、方法及操作步骤, 2、猪细小病毒PCR检测。 什么是PCR? 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 一、PCR反应的原理、方法及操作步骤 PCR原理 PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法,其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理,以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质,人为地控制体外合成系统的温度,以促使双链DNA变成单链;单链DNA与人工合成的引物退火,以及在dNTP存在下,耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性,低温退火,适温延伸等3步反应循环进行,使目的DNA得以迅速扩增。 PCR原理 PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等条件下,用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶,用合成的DNA引物代替RNA引物,经过DNA变性、引物与模板结合(复性)和延伸3个步骤的反复循环 (25?30次)过程,使目的DNA呈指数扩增 。 反应程序 变性:93-94℃ 2min 变性:93-94℃ 30s 复性:55-65℃ 30s 延伸:72 ℃ 30s 延伸:72 ℃ 2min 35个循环 PCR原理 Sample denaturatation Primer annealing Primer extension PCR product 标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10~100pmol 模板DNA 0.1~2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul 酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶:从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶:大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100 ul时) 浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 引物在线设计网址: /cgi-bin/ primer/primer3_www.cgi PCR产物分析 凝胶电泳分析法 可用琼脂糖(Agrose)或聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。 同时应以标准DNA分子量作平行对照,凝胶中加入溴化乙锭,电泳后,紫外检测仪下观察结果并拍照。 二 猪圆环病毒感染PCR检测-试剂盒 圆环病毒(PCV) 使用方法 注意事项: 作业 1、叙述PCR反应的原理、操作方法及注意事项。 2、叙述猪圆环病毒感染PCR检测的方法及结果判定。 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考,实际情况实际分析 主要经营:课件设计,文档制作,网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户,做到让客户满意! 致力于数据挖掘,合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面,打造全网一站式需求 * * * * * *
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