第四次分生讨论..pptxVIP

第四次讨论课;第一部分检测P53基因在血细胞中的表达情况;;一、RT-PCR技术;;一.RNA提取 1.取适量血浆,加入1mlTrizol,冰上匀浆 2.转入一新EP管中,室温保存5min 3.加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min 4.10000rpm4℃离心15min 5.转移上层水相到一新EP管中，加异丙醇0.5ml，振荡混匀，室温保存10min;6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。 7. 12000×g，4℃ 离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀 8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。 9. 7500×g，4℃ 离心，10min。 10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。 11. 沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水测OD260/OD280 12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。?;二、RT-PCR引物设计;;;;;? 1.??引物最好在模板cDNA的保守区内设计。?DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区 2.??引物长度一般在15~30碱基之间。?引物长度（primer?length）常用的是18-27?bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq?DNA?聚合酶进行反应。;? ?3.??引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。?GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting?temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=?4 （G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.?引物3′端要避开密码子的第3位。?如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 ;5.?碱基要随机分布。?引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False?priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G?或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 6.???物自身及引物之间不应存在互补序列。?引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。?两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′?端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross?dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。?引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR?反应不能正常进行 ;目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System ?for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。?;3. 取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA ? 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。轻轻混匀，离心。42 ℃孵育2-5 min；? 4.加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42 ℃水浴中孵育50 min；? 5. 于70 ℃加热15 min以终止反应；?? 6.将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37 ℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20 ℃保存备用。??;?? （1）取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA ? 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；?? （2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心；?? （3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目