冷藏与冷冻解冻猪肉酵素活性检验方法.doc

冷藏與冷凍解凍豬肉酵素活性檢驗方法 1、 適用範圍：適用於判定塊狀冷藏與冷凍解凍豬肉。 2、 原理：凍結處理會破壞肌肉細胞之粒線體，解凍時粒線體中之酵素會釋放至肌漿中，因此測定肌漿中粒線體β-羥基醯輔酶A去氫酶（β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADH）之活性，即可暸解豬肉是否經過冷凍處理。 3、 儀器設備及藥品 3.1 試藥 3.1.1 磷酸氫二鉀（K2HPO4）：試藥級。 3.1.2 磷酸二氫鉀（KH2PO4）：試藥級。 3.1.3 Ethylene-dianitrilo-tetra-acetic acid（EDTA）：試藥級。 3.1.4 還原型菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸（β-NADH Sigma-Aldrich）：對照用標準品。 3.1.5 乙酸乙醯基輔酶A（Acetoacetyl-CoA Sodium，Sigma-Aldrich）：對照用標準品。 3.2 去離子水：比電阻於 25℃ 可達18ΜΩ.cm以上。 3.3 儀器設備及器材 3.3.1 分光光度計：波長340 nm。 3.3.2 搾肉汁器：2塊厚1.5 cm之壓克力板，搾取肉汁。 3.3.3 利刃。 3.3.4 塑膠培養皿。 3.3.5 漏斗。 3.3.6 濾紙：Whatman No.2。 3.3.7 定量瓶：25 mL。 3.3.8 塑膠試管：5 mL。 3.3.9 塑膠離心管：50 mL。 3.3.10 石英管：3 mL， 1 cm × 1 cm 管徑。 3.4 試劑配製 3.4.1 0.1 M磷酸緩衝液（pH 5.5）：秤取K2HPO4 17.4 g 及KH2PO4 13.6 g ，分別以蒸餾水溶成 1 L 後，混合兩種溶液調整至pH 5.5，置於 4 °C 冰箱備用。 3.4.2 26.9 mM EDTA溶液：100 mg EDTA溶於10 mL蒸餾水後冷藏備用。 3.4.3 7.1 mM還原型菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸（β-NADH，SIGMA-ALDRICH）溶液：5 mg NADH溶於1 mL蒸餾水冷藏備用。 3.4.4 5.9 mM乙酸乙醯基輔酶A（Acetoacetyl-CoA Sodium，SIGMA-ALDRICH）溶液：5 mg之Acetoacetyl CoA溶於1 mL蒸餾水後冷藏備用。 4、 操作流程 4.1 肉汁製備 4.1.1 冷凍塊狀豬肉於試驗前48小時取出置於4°C冷藏櫃中解凍，以利刃取下約2 -3 g 肉（1.5 × 1.5 cm），切口表面以0.1 M磷酸緩衝液沖洗，再以紙巾擦乾表面。 4.1.2 將肉放在兩塊厚約 1.5 cm 之壓克力板間，旋緊螺絲以搾取肉汁，並以塑膠培養皿收集肉汁。 4.1.3 肉汁以 0.1 M 磷酸緩衝溶液稀釋200倍，並經濾紙（Whatman No.2）過濾後備用。 4.2 酵素活性測定步驟 4.2.1 取2.6 mL 0.1 M 磷酸緩衝溶液加入 1 cm × 1 cm 管徑之石英管中。 4.2.2 加入0.2 mL 26.9 mM之EDTA溶液。 4.2.3 加入0.05 mL 7.1 mM之β-NADH溶液。 4.2.4 加入0.1 mL稀釋200倍之肉汁後混合均勻；對照組加入0.1 mL去離子水。 4.2.5 加入0.05 mL 5.9 mM 之Acetoacetyl-CoA，立刻混勻並置入分光光度計（Spectrophotometer, SHIMADZU，UV-1800型；Beckman Coulter，DU 700），以波長340 nm測定反應0、1、2及3分鐘之吸光值（O.D.），扣除對照組之吸光值後，計算每分鐘NADH之降解速率（△E/min）。 5、 HADH酵素活性之計算 　　　　Units/mL肉汁＝（△E/min × 3 × 肉汁稀釋倍數）／（6.3 × 0.1） 　　△E/min：平均每分鐘吸光值之差值 　　3：石英管中混合液之總體積（mL） 　　6.3：在波長340 nm下β-NADH消失係數 　　0.1：添加稀釋肉汁mL數 ? 備註：判定標準以HADH酵素活性5.5 Unit/mL為界，當測值低於5.5 Unit/mL以下者，可判定樣品為冷藏豬肉；測值高於5.5 Unit/mL以上者，可判定豬肉為經過冷凍處理。