实验二、利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性.pptVIP

实验步骤 1. 菌种的活化及酶的诱导表达 菌种活化：挑 pET28a-svixyn/BL21(DE3)单菌落于、 5ml LB+Km液体培养基37℃培养18h。 酶的诱导表达：1%的接种量转接于20mlLB+Km液体培养基于37℃培养至OD600=0.5-0.6，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，于30℃摇床振荡培养2-6h，以 空载体为对照。 2. 融合蛋白的可溶性分析： (1). 12000rpm 离心收集菌体，溶于无菌水中； (2). 超声破碎菌体：功率 200W，4sec，破碎90次，至菌液澄清； (3). 12000rpm离心5min收集上清； (4). 将沉淀悬于无菌水中； (5). 分别取上清、沉淀做样品处理及SDS分析。 3. 样品处理：向样品中加入等体积的SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5min，冷却后上样或-20℃保存。 制胶：事先装好电泳板，配分离胶后立即用注射器灌胶，加少量水覆盖胶平面，聚合30min；倒掉或用吸水纸吸干水后，灌浓缩胶，插上梳子，聚合30min。 点样：小心将梳子拔掉；加入电泳缓冲液没过高低玻璃板中的低板，加样20-40μl。注：一定要记住点样顺序 电泳：稳压，浓缩胶电压 60V，电流约为10-15mA；分离胶电压150V，电流约25-30mA，电泳3-4