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药物分析 开题报告 苏少彬、罗鸣、郭润聪、高铭 2016/4/25  HPLC测定自制维C片剂中维C含量 前言 维生素C片为白色或淡黄色固体，密度为 1.63g/cm3，熔点190-192℃ (463- 465K) (分解)，摩尔质量为176.13 g/mol，LD50 = 11.9 g/kg (oral, rat)。易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚等。维生素C分子结构中的二烯醇结构使其表现为一元酸，pKa1= 4.10，pKa2 = 11.6，在碱性条件下易开环降解。维生素C有二个手性碳原子，故有四个光学异体，分别为L-抗坏血酸、D-抗坏血酸、L-异抗坏血酸、D-异抗坏血酸(见图 1) [1]。其中 L-抗坏血酸即为维生素C。D-异抗坏血酸的生理作用，在抗坏血方面的作用只有抗坏血酸的 1/20，但抗氧化性能优于抗坏血酸，主要作为食品添加剂使用。维生素C片为维生素类非处方药药品，用于预防坏血病，也可用于各种急慢性传染疾病及紫癜等的辅助治[2]。 维生素C分子结构中的二烯醇结构具极强的还原性，易被氧化为二酮基而生成去氢抗坏血酸，此反应为可逆反应。维生素C性质不稳定，易被氧化生成去氢维生素C，进一步水解生成2，3-二酮古龙糖酸，进而分解产生2、3、4－三羟丁酸和草酸，反应过程中，金属离子（特别是铜离子）对其有催化作用。详见图2。 国内目前研究维生素C测定方法的报道较多，有碘量法[1]、紫外分光光度[3]、激光拉曼光谱法[4]、薄层扫描法[5]、核磁共振内标法[6]、毛细管区带电泳法[7]、高效液相色谱法[8-11]等，各种方法各有特点。常用的《中国药典》标准碘量法方法简单，但滴定有色物质终点时颜色不易判断，前处理步骤烦琐，专属性不强。紫外分光光度法操作简单、结果准确，但样品批次较多时，测定费时。激光拉曼光谱法测定简单、操作方便，独有无需添加其他任何化学试剂的优点，是一种绿色环保的测定分析方法。但成本过高，且不能直接用于测定维生素 C片剂的含量。薄层扫描法是利用维生素C具有较强还原性，可使蓝色染料2, 6-二氯靛酚钠定量地还原成无色的酚亚胺，而本身被氧化成去氢抗坏血酸的特征反应测定维生素C含量[5]。核磁共振内标法是以结构分析为基础的分析方法，结构分析、定性分析、定量分析可同步提高分辨率。该法简便、准确，其准确度和精密度可以接近高效液相色谱法[6]。毛细管区带电泳法是近几年新兴的分析方法，具有效率高、分析时间短、样品处理简单等特点，但有待于进一步完善[7]。而本实验采用高效液相色谱分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作方便、自动化，应用范围广，定性定量方便，且不损坏样品，可与其他技术联用进一步检测分析。 本实验旨在探索方便、准确的维C含量测定方法，并进一步优化获得较好的专属性和重现性等，有望广泛用于维C片中维C含量测定，舍弃繁琐的操作过程或者复杂的测定原理和测定条件，方便后续工作者的检测工作。 图1 四种维C的光学异构体 图2 维生素C烯醇结构对质子进行亲核攻击，形成二酮 实验内容： 本次实验通过参考药典及文献设计了实验方案，拟用HPLC法对实验室自制的维生素C片剂的含量进行测定，并将对设计方案的准确度（方法回收率），稳定性，专属性，重复性，中间精密度，线性及范围，耐用性七项进行方法学验证。 含量测定 资料检索 本实验参照36版《美国药典》维生素C注射液含量测定与2013年版《英国药典》维生素C原料有关物质项下的方法，将色谱条件及色谱柱进行优化。《美国药典》选用的色谱柱填料为亲水全多孔聚羟基甲基丙烯酸酯(L39色谱柱)，该色谱柱较为特殊，耐用性差，故未选用此法。《英国药典》流动相配制时将乙腈加入磷酸盐溶液中溶液澄清，将磷酸盐溶液加入乙腈中溶液浑浊，说明流动相中盐浓度较大，配制时应注意二者混合顺序；该法选用氨基柱，在前期试验中发现氨基柱所需平衡时间长，保留时间容易漂移，并且该流动相易使氨基柱柱压升高，使用寿命缩短。经查阅相关文献[8~11]，流动相选用磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾4 g与磷酸二氢钾16 g，加煮沸过的冷水溶解并稀释至2000 mL，pH调节至6.0±0.1)－甲醇( 95:5) [8]；由于维生素C水溶性好，且在酸性条件下相对稳定，结合2015年版《中国药典》维生素C片含量测定项下供试品溶液的配制方法，第一步溶解时选用加有稀醋酸的水溶液，第二步使用流动相稀释；选用疏水性C18柱，既能达到良好的分离效果，又节约了实验成本。 HPLC色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶 流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾4 g与磷酸二氢钾16 g，加煮沸过的冷水溶解并稀释至2000 mL，pH调节至6.0±0.1)－甲醇( 95:5) [8] 检测波长：243 nm 流速：1.0 ml/min