果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速测定-吉林地方标准.docVIP

吉林省质量技术监督局 发布2009-07-02实施2009-07-02发布果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测--荧光PCR方法Method for rapid detection of Alicyclobacillus spp. in juice products-- The real-time PCR methodDB 吉林省质量技术监督局 发布 2009-07-02实施 2009-07-02发布 果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测--荧光PCR方法 Method for rapid detection of Alicyclobacillus spp. in juice products-- The real-time PCR method DB22/T1162—2009 DB22 吉林省地方标准 ICS67.050 X04 备案号： 前 言 本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院。 本标准主要起草人：史艳宇，刘俊会，华蕾，安伟，李媛媛，逄晓阳，王莹，王伟，李刚等。 本标准系首次发布的地方标准。 果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测--荧光PCR方法 范围 本标准规定了果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的荧光PCR检验方法。 本标准适用于果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 定义、术语和缩略语 下列定义、术语和缩略语适用于本标准。 3.1 脂环酸芽孢杆菌 Alicyclobacillus spp. 脂环酸芽孢杆菌是一群耐热、嗜酸的杆状芽孢菌，革兰氏染色为阳性至可变，其在pH范围2.0~6.0，温度为45℃时生长良好。 3.2 缩略语 3.2.1 P 3.2.2 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧 3.2 3.2 3.2 3.2.6 dGTP: deoxy 3.2 3.2.8 dUTP: deoxyuridine triphosphate，脱氧 3.2 3.2 3.2.11 C 原理 采用TaqMan方法，在比对脂环酸芽孢杆菌16S r RNA基因序列的基础上，设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针。探针5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示)，3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表示)，它在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5’→3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 试剂和材料 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为灭菌双蒸水。 K液体培养基(见附录A)。 引物 5’- CGTAGTTCGGATTGCAGGC -3’ 5’- GTGTTGCCGACTCTCGTG -3’ 探针 5’-FAM-CGGAATTGCTAGTAATCGC-TAMRA-3’ 5.4 Taq DNA聚合酶。 5.5 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。 5.6 DNA提取试剂：0.1%Chelex100水溶液。 5.7 10×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（Ph8.4），200 mmol/L氯化钾，15 mmol/L氯化镁。 5.8 脂环酸芽孢杆菌质控菌株：ATCC 49025。 6 仪器和设备 6.1 荧光PCR仪。 6.2 离心机:20 000 rpm/min。 6.3 微量移液器：10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。 6.4 水浴锅。 7 检验程序 24 h-48 h 24 h-48 h 样 品 25 mL (g) + K液体培养基225 mL 取1 mL菌液进行细菌模板DNA提取 荧光PCR检测 结果报告 47 图1 荧光PCR检测脂环酸芽孢杆菌程序图 8 步骤 8.1 取样和增菌 取样前消毒样品包装的开启处和取样工具。以无菌操作取样品25 mL (g)，加在225 mL的K液体培养基中，振摇使样品充分混合后，47℃恒温振荡培养24 h~48 h。