酶联免疫吸附分析.pptVIP

抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性 一、ELISA原理 ELISA原理 ELISA原理 ELISA原理 ELISA要有三个必要的试剂，即免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）系列参考标准品（定量测定）；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液；（7）反应终止液。 ELISA试剂的作用 2.1 免疫吸附剂： 已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。 固相载体： 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。 包被 将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。 载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被固相载体表面剩余吸附位点的过程。 蛋白质抗原或抗体包被时所用的一般浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的吸附位点，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些吸附位点，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附，增加ELISA反应得专一性和灵敏度。 封闭的程序与包被过程相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。研究表明，脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。 2.2 酶标记物 即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。 酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。 此外酶标记物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 2.3 酶的底物 2.3.1、HRP的底物　HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：　　DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB) 2.3.1 HRP的底物 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。 TMB经HRP作用后产物显蓝色，酶反应用HCl或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。。 　 2.4.2 AP的底物 　　AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。 2.5 洗涤液涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。