酶联免疫分析法.pptVIP

3、化学发光剂 用作标记的化学发光剂应符合以下条件： ①能参与化学发光反应； ②与抗原或抗体偶联后能形成稳定结合物； ③偶联后仍保留高的量子产率和反应动力； ④不改变或极少改变被标记物的物理化学特性，特别是免疫活性。 常用的化学发光剂有吖啶酯类化合物、氨基苯二酰肼类化合物、咪唑类化合物、苯酚类化合物、芳基草酸酯类化合物等。 第三节 发光酶联免疫分析 （1）吖啶酯类化合物 吖啶酯是三环有机化合物，很容易氧化。 当其在碱性介质中氧化时，经历共价键的断裂，产生二氧酮的中间体，然后形成电激发的N-甲基吖啶酮。当它回复到基态时在430nm处释放出光子。 在加入H2O2及随后加入NaOH调节至所需pH之前维持一低pH以实现最佳氧化过程，可加速其氧化反应。 吖啶酯氧化反应如图7-12所示。 第三节 发光酶联免疫分析 图7-12 吖啶酯氧化反应过程 第三节 发光酶联免疫分析 吖啶酯类化学发光剂的典型代表是光泽精（N,N′-二甲基吖啶硝酸酯）。 它在碱性条件下，与H2O2等过氧化物作用形成发光体激发态N-甲基吖啶酮。 能促使光泽精激发的物质还有丙酮、次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、羟胺及抗坏血酸等。 光泽精的氧化反应如图7-13所示。 第三节 发光酶联免疫分析 图7-13 光泽精的氧化反应 第三节 发光酶联免疫分析 吖啶酯类化合物作为化学发光标记物有显著的优点： ①氧化反应不需催化剂，只需要在碱性环境中就可以进行，发光反应快速，在1s内光子散射达到高峰，整个过程在2s内完成，可充分计数，背景噪声低。 ②这类化合物与被标记物的结合发生在分子一定部位，在氧化反应过程中，结合物被分解，吖啶酯分子从发光的部分断裂并分离下来，所以吖啶酯的发光不受抑制，敏感度不受标记反应的影响，试剂稳定性好。 第三节 发光酶联免疫分析 （2）氨基苯二酰肼类化合物 鲁米诺（5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮）、异鲁米诺（6-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮）及其衍生物如氨丁基乙基异鲁米诺（ABEI）、氨己基乙基异鲁米诺（AHEI）、氨丁基乙基鲁米诺（ABENH）等均属于这一类化学发光剂。 鲁米诺类化合物的发光反应必须有催化剂（如过氧化物酶）催化，且与蛋白或肽结合后其发光作用减弱，因此鲁米诺类化合物在CLIA中是很好的底物，但已较少用于CLIA的标记。 第三节 发光酶联免疫分析 图7-14 鲁米诺、异鲁米诺及其某些衍生物的结构式 第三节 发光酶联免疫分析 图7-15 鲁米诺化学发光反应过程 第三节 发光酶联免疫分析 （3）咪唑类化合物 咪唑类发光剂主要是咯吩碱。 其反应过程首先是咯吩碱在碱性二甲亚砜水溶液中形成过氧化物中间体，再进行重排，降解，伴随产生化学发光，如图7-16所示。 第三节 发光酶联免疫分析 图7-16 咯吩碱的化学发光反应 第三节 发光酶联免疫分析 （4）苯酚类化合物 用于化学发光免疫测定的酚类物质主要是邻苯三酚（焦性没食子酸），它是一种强还原剂，在催化剂（如HRP、血红素）催化下，与H2O2反应产生化学发光。 （5）芳基草酸酯类化合物 这类化合物主要有双-（2,4,6-三氯苯基）草酸酯（TCPO）和双-（2,4-二硝基苯基）草酸酯（DNPO）。 此类物质的发光反应是在反应体系中加入一种荧光染料如8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）作为荧光载体，通过过氧化草酸酯中间产物捕获化学能，使荧光体处于激发态，退激至基态时，放出光子。 第三节 发光酶联免疫分析 二、化学发光酶联免疫分析 1、化学发光酶联免疫分析 以在酶催化反应中可以产生化学发光的发光物质作为底物，以化学发光法检测酶的活性，则为化学发光酶联免疫分析（chemiluminescent enzyme immuno- assay，CLEIA）。 CLEIA方法的检测限低至10-17mol/L，达到或超过放射免疫分析的灵敏度。 化学发光酶联免疫分析实际上是一种酶联免疫测定过程。 第三节 发光酶联免疫分析 2、CLEIA常用的标记酶 CLEIA方法中最常用的是辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶（GOD）。 此外还有丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、萤火虫素酶、碱性磷酸酶（AP）和β-D-半乳糖苷酶等。 HRP标记的CLEIA，常用的底物为鲁米诺或其衍生物。 第三节 发光酶联免疫分析 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L、pH8.6的Tris缓冲液作底物液，鲁米诺和H2O