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3T3-L1细胞实验操作 3T3-L1 小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪） 培养基配制 （准备1L高压过的超纯水） 1、DMEM粉倒入1L放旋子的烧杯，加灭菌水1000ml，盖锡纸磁力搅拌40分钟。 2、擦净，加入3.7g Na2CO3，盖锡纸磁力搅拌10分钟。 3、称2.38g HEPES（4℃保存），盖锡纸磁力搅拌20分钟。 4、拿过滤嘴、针筒，用针筒吸配好的培养基，通过滤嘴过滤至高压过的100ml瓶分装，4℃保存，用时加10ml血清配成10%FBS。 顺便先配诱导液： 配好的培养基分装入100ml瓶中，90mlDMEM。 准备好FBS、IBMX、DEX、insulin（2μg/ml） 先配两瓶100ml 10%FBS， A液：IBMX 1ml + DEX 100μl + insulin 250μl 入 100ml 10%FBS B液：insulin 250μl 入100ml 10%FBS （先过滤） 细胞冻存 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌） 1、准备 DMEM（分装好的）* 1瓶，50 ml瓶 * 2，针，过滤器 * 1，DMSO试剂，冻存管。 2、配冻存液（10ml）： 按5：4：1比例 → 培养基 5ml ：血清 4ml ：DMSO 1ml ，混匀。 拿出一个新的、标记好用 针筒 把 过滤器 弄在 瓶口 用 针筒 吸 新配的冻存液，把针头 摘掉，经 过滤器 把 新配的冻存液 滤到新瓶。 PBS清洗细胞，加完盖盖子，加在壁上，然后吸弃，换枪头吸（一对一）。 吸 胰酶500μl（吸匀再用），放显微镜观察，消化完毕即吸弃（一对一）。 大皿加入2~3ml冻存液，打圈吹散，分装1ml至冻存管，勿离心。 -4℃ 30min，-20℃ 1h，-80℃ 2h，最后液氮冻存。 一、细胞复苏 （准备10%FBS、晚上复苏） 将从液氮取出冻存管放入37℃恒温水箱搅拌解冻。 将细胞悬液软管吸取至培养皿中，加入5~6 ml10%FBS，混匀。 培养过夜后进行换液。 二、细胞传代 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌） 10%FBS 即 90mlDMEM + 10ml血清 半个月内用完 1、缓慢吸走旧培养基，换枪头，用2ml DMEM清洗，后吸弃。 2、加500μl胰酶，在显微镜观察细胞形态，大部分消化成方形即可吸弃胰酶。 3、加入2ml10%FBS，打圈混匀，吸1ml，每皿大概5~6滴入新的培养皿（大皿10滴~1ml），其余弃掉，后加3ml10%FBS（大皿8ml），大概可2天传代。 4、换液时需缓慢吸弃旧培养基，DMEM清洗细胞（注意换枪头杜绝污染）后吸弃，10%FBS贴壁加入3ml。 三、细胞接板 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌） 24孔板：560μl 细胞+6ml 10%FBS （12个样） 【600μl 分化 1.2ml 增殖】 12孔板：1400μl细胞+11ml 10%FBS 用25ml瓶一板对一瓶装 准备好12孔板、24孔板各两份（两皿细胞）、DMEM、血清、25ml瓶4个、软管。 配10%FBS 90ml DMEM+10ml 血清 第一二瓶 各6ml 10%FBS，第三四瓶 各11ml 10%FBS 吸弃旧培养基，加2ml DMEM摇晃清洗，吸弃，500μl一皿细胞胰酶消化，显微镜观察细胞分散开来即停止消化。 每皿加入2ml 10%FBS，1ml枪头打圈吹散。 将两皿细胞集中在一个培养皿，打圈吹散。 560μl细胞分别加入一二瓶混匀，1400μl细胞分别加入三四瓶混匀。 一二瓶对应加500μl细胞进24孔板（加12个孔）摇晃混匀， 三四瓶对应加1ml细胞进12孔板，摇晃混匀。放培养箱，第二天进行转染。 四、细胞转染 （无酶EP管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌） 1、准Opti-MEM ，灭菌水，mic（inhibitor），NC，Lipo3000，无酶EP管、无酶小管，96孔枪头板，12孔板、24孔板各2板（工具照紫外） 2、NC、mic（inhibitor）4℃ 1500r 1.5min离心 3、分装Lipo3000 tube管150μl一管（轻混），mic（inhibitor）、 NC 小管（换枪头加灭菌水稀释，按说明书要求），标记好 4、分装Opti-MEM 20ml入瓶待用 5、计算好体系：(n为样品数量，N为总样品数量） Mic：①45μl + 600μl Opti-MEM （12孔板） 3.75 μl Mic * n + 50μlOpti-MEM * n； ②22.5μl + 300μl Opti-MEM （24孔板12个样）1.875μl Mi