蛋白质基础和检测技术.pptVIP

应用： 如在临床上用高温、高压、紫外线、75%酒精消毒就是利用了这些变性因素使细菌、病毒的蛋白质变性，从而失去致病作用。 在蛋白质的制备过程中，如果提取的目的蛋白是热稳定的，可利用热变形的方法很方便的除去其它杂蛋白。而对于不利的变性则应该尽量避免。 蛋白质的复性：是指有些蛋白质变性后，如果设法将变性因 素除去，该变性蛋白质尚能恢复其空间结构与活性。 利用蛋白质的复性特征可对包涵体蛋白质进行变性-复性纯化。 例如在包涵体蛋白质纯化过程中常用尿素或盐酸胍对包涵体进 行溶解，纯化获得目的蛋白后，再通过透析除去变性剂(尿素、 盐酸胍、β-巯基乙醇等)，或通过稀释减少变性剂的含量，则其 特定的氨基酸顺序重新卷曲、折叠成原来的天然构象，酶的活 性也恢复到原来的水平。 检测复性成功的方法： 非还原性电泳、生物活性检测、结构确认 6.6呈色反应 蛋白质分子中，肽键及某些氨基酸残基的化学基团，可与某些化学试剂反应显色，称为蛋白质的呈色反应。利用这些呈色反应可以对蛋白质进行定性和定量分析。 6.7 蛋白质的紫外吸收性质 这要来自酪氨酸和色氨酸对于280nm紫外光的吸收，可以对蛋白质进行定性和定量分析。 蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术，是确定蛋白质产品的是与非的问题，尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技术首先要对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。 蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参数很多。但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下几种： 蛋白质的质量鉴定(分子量) 蛋白质带电性鉴定(等电点) 蛋白质结构鉴定(一二级结构、晶体结构、肽谱、N和C-末端) 蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学) 免疫学鉴定(抗原-抗体反应、酶联免疫反应) 7 蛋白质的表征 7.1 蛋白质的纯化 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质的来源是多样的，主要来自动物、植物的各种组织和微生物，取材要采用含量丰富的器官。抽提蛋白质的第一步是将组织粉碎，破坏细胞，以便于抽提出蛋白质；第二步就是对抽提出来的蛋白质进行纯化。 7.1.1 几种常见的细胞破碎方法 (1)机械方法 ? ?? ?1)捣碎发；2)研磨法；3)匀浆法 (2)物理方法 ? ?? ?1)温差法；2)压差法 (3)生物化学方法 ? ???1)采用化学试剂甲苯、丙酮、氯仿、Triton等通过化学渗透使细胞内含物选择性的渗透出来；2)自溶法；3)酶解法 7.1.2 蛋白质的纯化方法 7.1.2.1将多组分蛋白质变为单一组分蛋白质 根据蛋白质的分子形状和分子质量大小、电离性质、溶解度和疏水性、生物功能专一性等，常用有各种盐析法、超离心沉降、结晶、电泳、凝胶过滤，离子交换层析、亲和层析、疏水层析等。近年来发展的FPLC和HPLC大大促进了许多蛋白质在毫克级的纯化，其量足够用于蛋白质的化学研究。 7.1.2.2 将大体积变为小体积 有吸附法、超滤法、冻干等。 7.2 蛋白质含量检测 在进行蛋白质含量测定时，首先根据蛋白质的物理化学性质的 特性和实验室的现有条件来确定测定方法。测定蛋白质含量通 常要采用两种以上的方法，要根据蛋白质的某些特性选择不同 的方法进行测定，将多种方法测得的结果综合考虑。 常用的蛋白质检测方法有： 紫外吸收法 凯氏定氮法 考马斯亮蓝法 FoLin－酚试剂法(Lowry法) 二喹啉甲酸检测法（BCA法） 双缩脲法 高效液相色谱法 毛细管电泳法 7.3 蛋白质纯度检测 一个天然蛋白或一个重组蛋白质，产品的纯度是一个 重要的指标。纯度的表示方法主要根据实际用途区分。如化 学试剂的纯度一样，主要有化学纯、分析纯、优级纯等。 蛋白质的纯度通常有两种方式表示： A、工业用的用百分含量表示：如：95％、99％、99.9％； B、实验室用的以用途表示：有实验室级纯(lab)、电泳纯(electrophoresis)、色谱纯(choromatography)。 蛋白质纯度分析有以下几种方法： 光谱法：鉴别蛋白质与非蛋白质 层析法：鉴别蛋白质与杂蛋白质 电泳法：鉴别蛋白质与杂蛋白质 N末端法：鉴别蛋白质 比活法：鉴别蛋白质 蛋白质纯度鉴定的原则： 在蛋白质的研究工作中，蛋白质的纯度鉴定是非常重要的技术，任何一个合格的蛋白质制品都有严格的准确的质量标准，其中蛋白质的含量测定和纯度鉴定是两项最重要的指标。在进行蛋白质样